Среды для выявления различных групп микроорганизмов

Для выявления молочнокислых бактерий, помимо солодового агара (12% СВ) с мелом используют следующие среды.

Среда МРС – 4 с сорбиновой кислотой (модифицированная А. А. Ленцнером). Готовится на основе среды МРС – 1.

Среда МРС – 1. В 200 мл дистиллированной воды растворяют 0,05 г MnSCv₄H₂0; 0,2 г цистеина; 0,2 г MgS0₄-7H₂0; 2 г К₂НРО₄; 2 г цитрата аммония; 5 г ацетата натрия; 20 г глюкозы; 10 г пептона; 1 мл твин-80; 50 мл дрожжевого автолизата, 100 мл печеночного экстракта. (Пептон и твин-80 растворяют отдельно в небольшом количестве горячей дистиллированной воды). Объем жидкости доводят дистиллированной водой до 500 мл и добавляют 500 мл гидролизованного молока. рН среды 6,2-6,6. Среду фильтруют, разливают в колбы или этробирки и стерилизуют 20 мин при 50 кПа.

Для приготовления среды МРС – 4 добавляют 2,5% агара и 0,04% сорбиновой кислоты. Сорбиновую кислоту прибавляют к среде после стерилизации.

Приготовление дрожжевого автолизата. 1кг прессованных дрожжей разводят до однородной суспензии в 3 л водопроводной воды, подогретой до 55-58°С. Суспензию помещают на 24 ч в термостат при температуре 55°С. Автолизат фильтруют и стерилизуют при 50 кПа в течение 20 мин.

Приготовление печеночного экстракта. 1 кг свежей говяжьей печени разрезают на мелкие кусочки, заливают 1 л водопроводной воды, затем кипят 30 мин и фильтруют. Стерилизуют 20 мин при 50 кПа.

Приготовление гидролизованного молока (по Богданову). Обезжиренное молоко разводят водопроводной водой (на 1 часть молока 2 части воды), кипятят 5 мин и охлаждают до 45°С. К 1 л молока добавляют 0,5 г панкреатина 5 мл хлороформа. (Порошок панкреатина предварительно разводят в небольшом количестве теплой воды). Колбу закрывают пробкой и ставят в термостат на 72 ч при 40°С. В течение первых 2-3 ч молоко в колбе несколько раз перемешивают. Пробку после встряхивания вынимают, для удаления паров хлороформа.

Через 72 ч гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,0-7,2 и стерилизуют при 50 кПа в течение 20 мин.

Агаризованная томатно-соковая среда. 400 г готового томатного сока, 100 мл дрожжевого автолизата, 10 г пептона, 20 г глюкозы, 5 г NaCl и 15 г агара на 1000 мл дистиллированной воды, рН среды – 6,1. Стерилизация при 50 кПа 20 мин.

Агаризованная капустная среда. 200 г мелкоизмельченной капусты помещают в кастрюлю, заливают 1 л воды и кипятят в течение 10 мин. Затем отжимают через двойной слой марли, а полученную жидкость фильтруют через бумажный фильтр. Полученный отвар разводят в два раза водой, добавляют 2% глюкозы, 1% пептона и 2% агара, рН среды – 6,2-6,5. Стерилизуют при 50 кПа 15 мин.

Среда-10. К 1 л солодового сусла 8% СВ добавляют: 0,05 г MnS0₄∙4H₂0; 0,2 г MgS0₄-7H₂0; 0,2 г цистина или цистеина; 2 г К₂НРО₄; 0,2 г цитрата аммония; 2,5 г акетата натрия; 20 г сахарозы; 10 г пептона; 50 мл дрожжевого автолизата; рН среды 5,5. К среде добавляют 1,5% агара. Стерилизуют троекратно текучим паром. При посеве добавляют стерильный мел в чашки Петри.

Синтетическая среда с лизином для выявления аспорогенных ("диких") дрожжей. В 1 л водопроводной воды растворяют 50 г глюкозы, 3 г лизина, 1 г КН₂РO₄, 1 г MgS0₄ и FeS0₄ (следы). Добавляют 1,5% агара и стерилизуют при 50 кПа 20 мин.

Среды для выявления споровых бактерий – картофельной и сенной палочек. Мясопептонный агар. 5 бульонных мясных кубиков (20 г) растворяют в 1 л воды, добавляют 10 г пептона и 2% агара. Агар расплавляют и среду кипятят в течение 30 мин. Затем среду фильтруют через марлю и вату и стерилизуют при 100 кПа 10 мин.

Дрожжевой агар с сахарозой и нистатином. К дрожжевой воде добавляют 1,5% агара, расплавляют его, добавляют 4% сахарозы и стерилизуют при 50 кПа 20 мин.

Дрожжевая вода. 80 г прессованных дрожжей разводят в 1 л водопроводной воды. Смесь кипятят 20 мин, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют при 100 кПа 20 мин.

Антибиотик нистатин вносят в чашки Петри перед посевом (по 1 мл водного или спиртового раствора нистатина). Раствор его готовится в стерильной воде с таким расчетом, чтобы фунгицидная концентрация 1 мл раствора была достаточна для подавления роста дрожжей в одной чашке Петри.

Например, для 15 мл среды и посевного материала необходимо приготовить раствор нистатина из расчета 300 ед. в 1 мл. При активности нистатина 3000 ед. в 1 мл нужно взять навеску в 10 мг водорастворимого нистатина и растворить в 100 мл стерильной воды. (Спирторастворимый нистатин в воде растворяется не полностью, образуя крупинки, поэтому навеску антибиотика увеличивают в 10 раз). Нистатин хранят в темном, холодном месте, так как на свету он разрушается. Растворы нистатина хранят в холодильнике не более 2-3 суток.

Пробы перед посевом для выявления споровых бактерий прогревают при 80-90°С. 10-15 мин, чтобы убить все вегетативные формы микроорганизмов.

Молочный агар для выявления гнилостных неспоровых бактерий. Обезжиренное молоко разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют 20 мин при 50 кПа.

Отдельно готовят водный агар (3%-ный), разливают по пробиркам по 3-4 мл и стерилизуют 0,5 ч при 100 кПа. Перед разливкой в чашки Петри агар расплавляют и соединяют с молоком. Гнилостные бактерии выявляются по зонам растворения казеина вокруг колоний.

Среды для выявления лейконостока. Для выявления лейконостока используют дрожжевой агар с сахарозой или среду – 10, приготовленную на основе дрожжевой воды, а не солодового сусла. На дрожжевом агаре с сахарозой лейконосток образует характерные каплевидные, прозрачные колонии.

Среды для идентификации молочнокислых бактерий и дрожжей

Для определения вида молочнокислых палочек по схеме А. А. Ленцнера используют следующие среды.

Среда Абд-эль-Малека (для выявления газообразования).

В 150 мл профильтрованного готового томатного сока растворяют при подогревании 0,75 мл твин-80 и 37,5 г глюкозы, прибавляют 5 мл дрожжевого автолизата, 600 мл обезжиренного молока и 150 мл расплавленного 2%-ного мясопептонного агара и устанавливают рН 7,0. Среду разливают в пробирки по 6-7 мл и стерилизуют 20 мин при 50 кПа.

Перед употреблением среду растапливают в водяной бане и охлаждают до 40°С. После засева среде дают застыть, затем сверху наслаивают агаровую пробку (1-2 мл расплавленного 2%-ного мясопептонного агара).

Среда МРС-2 (в модификации А. А. Ленцнера). Она предназначена для выявления роста молочнокислых бактерий при температуре 15°С и в присутствии 0,4% типуля. Среда полужидкая, готовится на основе среды МРС-1 путем добавления 0,15% агара.

Среда МРС – 3 для пестрого ряда (в модификации А. А. Ленцнера). В отличие от среды МРС – 1 не содержит глюкозы, печеночного экстракта и гидролизоваиного молока. Углеводы добавляют в количестве 0,5%. Среда содержит 0,15% агара. Индикатором служит хлорфеноловый красный в концентрации 0,004%. Индикатор растворяют в небольшом объеме спирта и добавляют в среду перед стерилизацией.

Среды для идентификации дрожжей сахаромицетов. Ацетатная среда (для выявления спорообразования у дрожжей). В 1 л воды последовательно растворяют 10 г ацетата натрия, 5 г КО и 20 г агара. Стерилизуют при 100 кПа 10 мин. Среда хранится длительное время.

Картофельный агар. 100 г очищенного картофеля нарезают тонкими ломтиками и выдерживают несколько часов в 300 мл водопроводной воды. Вытяжку фильтруют. К 230 мл картофельной вытяжки добавляют 770 мл воды, 20 г глюкозы и 30-35 г агара. Стерилизуют 1 ч при 70 кПа.

Синтетическая среда Ридер (для определения способности дрожжей сбраживать углеводы). В 1 л воды вносят 3 г (NH₄)₂S0₄; 0,7 г MgS0₄; 0,4 г Са(NO₃)₂; 0,5 г NaCl; 1 г

KH₂P0₄; 0,1 г К₂НРО₄ и 2% исследуемого сахара. Среду наливают в пробирки со стеклянными поплавками или в трубки Дунбара, и стерилизуют 20 мин при 50 кПа.

Среды для накопления дрожжей и молочнокислых бактерий

При накоплении дрожжей и молочнокислых бактерий для выведения заквасок, помимо солодового сусла, используют ржаную осахаренную болтушку.

Для приготовления осахаренной болтушки навеску ржаной обойной муки в количестве 100 г вносят в 1 л водопроводной воды, подогретой до температуры 45°С, хорошо перемешивают и помещают на 1 ч в водяную баню. Температура смеси должна быть 45°С. Далее температуру смеси поднимают до 55°С и поддерживают на таком уровне в течение 2 ч при периодическом перемешивании. Затем температуру смеси повышают до 63°С и выдерживают болтушку при данной температуре в течение 3 ч, периодически перемешивая.

По окончании ферментации осахаренную ржаную болтушку разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве при 100 кПа в течение 5 мин.

Среды для сохранения молочнокислых бактерий и дрожжей

Для сохранения молочнокислых палочек в условиях музейной коллекции кроме нефильтрованного солодового сусла концентрацией 12% СВ с мелом и полужидкой солодовой среды с мелом используют среду Дэйвиса, которую готовят так.

В 1 л обезжиренного молока вносят 10 г глюкозы, 50 мл дрожжевого автолизата и 100 г СаСО₃. Индикатор хлорфеноловый красный добавляют из расчета, чтобы окраска среды была бледно-розовой. Среду разливают по 15 мл в пробирки и стерилизуют 20 мин при 50 кПа.