Определение живых и мертвых клеток дрожжей

При производстве хлеба и хлебобулочных изделий широко применяются прессованные дрожжи и дрожжевое молоко. Их качество во многом зависит от физиологического состояния микроорганизмов, в частности от жизнеспособности клеток.

Методы выявления мертвых клеток основаны на различной проницаемости клеточных стенок Метод визуального счета

В хлебопекарной и дрожжевой промышленности количество мертвых клеток дрожжей обычно учитывают путем окрашивания пробы слабым водным раствором метиленовой сини по Финку. Для этого на предметное стекло наносят каплю исследуемой суспензии дрожжей и 1-2, капли красителя. Препарат покрывают покровным стеклом и через 2-3 мин подсчитывают в 10 полях зрения общее количество дрожжевых клеток и количество окрашенных клеток. При микроскопировании пользуются объективом 40X и окуляром 15Х.

Фотометрический метод

Отделом функциональной морфологии Института микробиологии в содружестве с лабораторией технологии дрожжей ВНИИХПа разработан метод определения процентного содержания живых и мертвых клеток дрожжей с помощью красителя конго-красный. Согласно данной методике о соотношении между живыми и мертвыми клетками судят по степени адсорбции и извлечения красителя из раствора определенными навесками дрожжей. Для этого готовят 2,5%-ную суспензию прессованных дрожжей. Часть ее прогревают до кипения, чтобы убить дрожжи. В 6 пробирок вносят по 4 мл приготовленной суспензии, при этом прогретые и нормальные пробы берут в разных соотношениях. К пробам добавляют по 0,4 мл водного раствора конго-красного концентрацией 1: 1000 и окрашивают в течение 1 ч. После этого суспензии центрифугируют, а на досадочную жидкость колориметрируют на фотоколориметре с синим фильтром, определяя количество оставшегося свободного красителя. Пример анализа приведен ниже.

По сравнительному количеству краски, не адсорбированной суспензиями дрожжей, с количеством оставшегося красителя в пробе с убитыми клетками судят о процентном содержании в образце мертвых клеток.

Люминесцентный метод

Среди современных, перспективных для практического применения приемов исследования живых и мертвых клеток заслуживают внимания методы люминесцентной микроскопии, так как они гораздо чувствительнее обычных методов окраски. Широкое признание получил способ выявления мертвых микроорганизмов с использованием флуоресцирующего красителя примулина. Примулин, накапливаясь в мертвых клетках, вызывает ярко-желтую люминесценцию. Суспензию дрожжей окрашивают раствором примулина 1:20 000-1:40 000 в течение 3-5 мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок разводят стерильной водой, готовят препарат и просматривают его под люминесцентным микроскопом. В данном случае мертвые клетки светятся желтым, а живые клетки почти не светятся и видны лишь в виде тусклых теней.

Чтобы учесть в одном и том же поле зрения живые и мертвые клетки дрожжей, сначала просматривают поле зрения при люминесцентном освещении и регистрируют все ярко светящиеся желтые дрожжевые клетки. Затем наблюдают это же поле зрения в условиях фазового контраста, подсчитывая все клетки дрожжей, как погибшие, так и живые. Всего в препарате просматривают 10 полей зрения. Результаты подсчета клеток суммируют и определяют процент мертвых клеток.

Флуориметрический метод

В Ленинградском отделении ВНИИХПа совместно с Ленинградским филиалом ВНИИ медицинского приборостроения разработан флуориметрический метод определения мертвых дрожжевых клеток на флуориметре марки ФБ – 1. Данный способ позволяет установить процентное содержание жизнеспособных клеток в объеме пробы без подсчета на столике микроскопа. Принцип действия прибора заключается в регистрации свечения флуорохрома примулина, связанного с мертвыми дрожжевыми клетками, в объеме среды при предварительном удалении из суспензии свободного красителя. Чем больше в пробе отмерших клеток, тем интенсивнее свечение взвеси, что регистрируется фотоумиожителем.

Флуориметр ФБ – 1 выпускается Киевским заводом медицинского приборостроения. Конструктивно он выполнен в настольном варианте и имеет форму удлиненного параллелепипеда с асимметрично расположенным и вынесенным из – под общего кожуха осветителем. Источником возбуждения служит лампа СВД-120А.

При разработке методики определения мертвых клеток на флуориметре были выбраны оптимальные величины концентрации примулина, соотношения между количеством красителя и культуры и продолжительности окрашивания. Опыты проводились на суточной чистой культуре дрожжей S. cerevisiae 90. Суспензию дрожжей предварительно кипятили в течение 10 мин, чтобы полностью убить клетки. При контрольном рассеве таких суспензий на чашках Петри не вырастало ни одной колонии дрожжей. В качестве флуорохрома использовали водный раствор примулина. Примулин выпускается отечественной химико-фармацевтической промышленностью. Он входит в набор красителей для флуоресцентной микроскопии.

Как видно из приведенных данных, наибольший выход флуоресценции можно получить, обрабатывая пробу дрожжей в течение 5 мин раствором примулина 1: 10 000 (10 мг красителя на 100 мл дистиллированной воды) при соотношении красителя и культуры 1:5. На основании проведенных испытаний была принята следующая методика приготовления проб для определения количества мертвых клеток на флуориметре ФБ – 1.

Исследуемые пробы прессованных дрожжей или дрожжевого молока предварительно разводят в водопроводной воде (1 г прессованных дрожжей или 2 мл дрожжевого молока на 100 мл воды). Полученную суспензию вносят в две пробирки, по 15 мл в каждую. Одну из пробирок (контроль) помещают в кипящую баню на 10 мин, чтобы убить все клетки. После этого объем жидкости в пробирке доводят водой до исходного объема 15 мл.

В контрольную и опытную пробирки вносят по 3 мл раствора примулина концентрации 1: 10 000 и окрашивают пробы в течение 5 мин. Для удаления не связавшегося с клетками красителя исследуемые суспензии центрифугируют при 6000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают (так, чтобы не потерять клетки дрожжей), а осадок дрожжей, как убитых нагреванием, так и не подвергавшихся кипячению, разводят в 15 мл воды. Пробами аккуратно заполняют кварцевые кюветы, прилагаемые к прибору, избегая образования пузырьков воздуха. Дополнительно одну кювету заполняют дистиллированной водой. Кюветы вставляют в специальные кассеты и флуориметрируют на ФБ-1.

Порядок работы на приборе ФБ-1 заключается в следующем. За 15 мин до начала работы прибор включают в сеть. При этом загорается сигнальная лампа измерителя. После прогрева прибора в проем на горизонтальной панели флуориметра вставляют кассету с двумя заполненными кюветами. Сначала кассету устанавливают в первое фиксированное положение, когда на пути светового луча располагается кювета с дистиллированной водой. Включают тумблер измерителя (при этом загорается сигнальная лампа измерителя) и с помощью ручек точной и грубой компенсации устанавливают стрелку микроамперметра на нуль. Затем переводят кассету во второе фиксированное положение и измеряют интенсивность свечения взвеси со 100% содержанием мертвых клеток, убитых кипячением. Если окажется, что интенсивность свечения чрезмерно велика, т. е. стрелка амперметра уходит за шкалу прибора, то необходимо уменьшить отверстие диафрагмы с помощью ручки управления диафрагмой и снова установить прибор на нуль. После этого вставляют вторую кассету с кюветой, заполненной исследуемой взвесью дрожжей, и снимают отсчет по измерительному прибору.

Время измерения одной пробы не превышает 1 мин. Относительная погрешность определения находится в пределах 10%.

Объективный флуориметрический метод выявления мертвых дрожжевых клеток прошел апробацию при оценке качества прессованных дрожжей и дрожжевого молока.

Флуориметр ФБ-1 может быть использован также при анализе сушеных дрожжей, подборе дезинфицирующих веществ, режимов хранения дрожжей и решении ряда других проблем.