5.2.1.2. Проблема оценки генетического риска, обусловленного радиацией и другими мутагенными факторами окружающей среды

Проблема оценки степени риска для человеческой популяции, обусловленного радиацией и всеми другими мутагенными факторами, включает следующие вопросы:

1) Каким образом данный фактор действует на генетический материал?

2) Насколько широко подвергается человеческая популяция воздействию этого фактора?

3) Каково вероятное увеличение частоты мутаций по сравнению с частотой «спонтанных» мутаций?

4) Каковы долговременные последствия увеличения частоты мутаций для популяции?

В идеале на эти четыре вопроса должны отвечать ученые-естественники. Существует, однако, пятый вопрос, при подготовке ответа на который роль ученых-естественников может заключаться только в сборе данных. Ответ на него должно дать общество в целом.

5) Какова та степень увеличения числа мутационных повреждений, которую мы готовы терпеть в обмен на такие блага, как диагностическое и терапевтическое применение рентгеновских лучей, использование ядерной энергии, некоторых лекарств и др.

Принципы тестирования на мутагенность. Вопрос относительно механизма действия мутагенов на генетический материал очень сложен. Его можно подразделить на ряд более конкретных вопросов.

1. Какие типы мутаций индуцируются в данном конкретном случае-геномные, хромосомные или генные?

2. Где преимущественно они возникают: в половых клетках или в соматических?

3. Если они индуцируются в половых клетках, то

а) На какой стадии развития половых клеток происходит первичное поражение?

б) Передаются ли эти мутации следующему поколению или они элиминируются, скажем, в процессе мейоза?

в) Если они передаются, то какие фенотипические изменения можно ожидать у потомков?

4. Если мутации индуцируются в соматических клетках, то

230 5. Мутации

а) Какие клетки особенно подвержены такой опасности?

б) Каковы последствия их возникновения для индивида?

Все эти вопросы должны изучаться в ходе выполнения комплексной программы тестирования на мутагенность. Какие организмы должны при этом использоваться? С теоретической точки зрения ответ очевиден. Нас интересуют люди; поэтому было бы лучше всего, если бы мы изучали эти проблемы на человеке. Однако экспериментальные исследования на человеке невозможны по этическим соображениям. Мы можем изучать только ситуации, складывающиеся естественным образом; возникающие при этом обстоятельства обычно столь сложны, что у нас нет надежды на получение четких ответов. Поэтому во многих исследованиях, посвященных генетике человека, используются экспериментальные животные. Эти животные должны удовлетворять трем основным условиям.

1. Они должны быть достаточно близки к человеку, чтобы можно было осуществлять имеющие смысл экстраполяции. Неизбежные различия между экспериментальными видами животных и людьми должны иметь такой характер и порядок величины, чтобы они поддавались при проведении сравнения теоретическому или экспериментальному анализу.

2. Смена поколений должна быть быстрой, чтобы генетические эксперименты могли проводиться за разумное время.

3. Подопытные животные должны быть такими, чтобы их можно было содержать в большом числе на умеренные средства.

Единственным животным, удовлетворяющим всем этим условиям, является мышь (Mus musculus). Поэтому радиационная генетика млекопитающих представляет собой главным образом радиационную генетику мыши. Другие виды, такие как крысы, китайские хомячки или обезьянымармозетки, используются лишь эпизодически. По этой причине последующие разделы будут посвящены в основном мутагенезу у мышей, хотя они и содержат определенные выводы, касающиеся человека. Для сравнения приводятся имеющиеся данные о человеке и о других видах.

Тест-системы для идентификации различных мутаций in vivo в половых клетках мыши. Тест-системы с использованием этого животного можно подразделить на системы in vivo и in vitro и на системы для идентификации мутаций в половых и соматических клетках.

Существующие тест-системы для выявления мутаций в половых клетках представлены на рис. 5.48. Предположим, что мутация индуцирована в сперматогонии. Если эта мутация является хромосомной, она может быть идентифицирована сразу в процессе митотических делений сперматогониев. В течение первого и второго мейотических делений можно наблюдать влияние мейоза на индуцированные аберрации. Гаплоидная фаза сперматогенеза до сих пор была недоступна для изучения (см., однако, [431, 432]). Последующие митотические деления происходят во время раннего эмбрионального развития особей поколения ¥_у. На этой стадии эмбриогенеза можно вымывать зиготы из фаллопиевых труб и изучать их хромосомы.

При приготовлении препаратов ооцитов из яичников можно наблюдать первые мейотические деления женской половой клетки. Регулируя время между копуляцией и умерщвлением животного, можно изучать или стадию ооцита, или стадию ранней зиготы. Культивирование ооцитов позволяет продлевать дробление на значительное число делений.

Имплантация зиготы в матку происходит на 9-й день беременности; в это время зигота находится на стадии бластоцисты. Несколькими днями позже становится возможным выявление имплантированных эмбрионов. Признаком, по которому выявляют места имплантации эмбрионов, погибших вскоре после имплантации, служат так называемые децидуомы.

Визуальному обнаружению поддаются некоторые эмбрионы, погибшие на более поздней стадии, а также здоровые

5. Мутации 231

Рис. 5.48. Тест-системы для изучения последствий действия мутагенного фактора in vivo с использованием мышей. Подробности см. в тексте.

эмбрионы. Децидуомы вместе с эмбрионами, погибшими позднее, представляют собой следствие постимплантационных потерь зигот. Из различия между числом желтых тел в яичниках и общим числом имплантаций можно сделать вывод о существовании предимплантационных потерь. Предимплантационные и постимплантационные потери зигот обычно связывают, если не показано, что они обусловлены негенетическими факторами, с «доминантными деталями». Несмотря на существование более современных методик, метод доминантных деталей все еще остается стандартным при тестировании на мутагенность [1603]. Эмбрионы на поздней стадии развития могут проверяться на наличие у них хромосомных аномалий.

Все методы, применявшиеся при исследованиях животных, доживающих до этой стадии поздней беременности, - это методы цитогенетические. В настоящее время хромосомные и геномные мутации, индуцированные на ранних стадиях развития половых клеток, можно выявлять на всех этапах вплоть до сформирования новорожденного животного. Идентификация митотических хромосом в соматических тканях после рождения животного не вызывает никаких затруднений.

Для выявления точковых мутаций необходимо дожидаться рождения животного. Существуют методы идентификации ряда доминантных и рецессивных мутаций при рождении. К доминантным принадлежат мутации, влияющие на скелет. Один из таких методов описан в разделе 3.6.2.5. Индуцированные мутации скелета обнаруживают неожиданно высокую степень неполной пенетрантности и варьирующую экспрессивность.

Метод множественных рецессивных мутаций. Метод выявления рецессивных мутаций был одним из первых, разработанных для исследований в области радиационной генетики. Он позволяет с большой точностью выявлять мутации в небольшом числе локусов. Многие из основных результатов в области радиационной генетики мыши получены с использованием этого метода. В этом случае самцов дикого типа скрещивают с самками тестерной линии, гомозиготной по семи аутосомно-рецессивным мутациям. Если индукции мутаций не произошло, все животные F₁ гетерозиготны и имеют нормальный (дикий) фенотип (рис. 5.49). Однако если в отцовской половой клетке индуцирована какая-либо из этих семи мутаций, животное F₁ будет гомозиготно по данной мутации и проявит соответствующий фенотип. Мутации для тестерной линии выбираются таким образом, чтобы

232 5. Мутации

Рис. 5.49. Принцип метода множественных рецессивных мутаций. Самца дикого типа (вверху слева) облучают и скрещивают с самкой из тестерной линии (вверху справа). Если индукции мутаций не происходит, потомство будет гетерозиготным по тестерным локусам и, следовательно, будет иметь нормальный (дикий) фенотип (внизу слева). Если один из сперматозоидов в одном из семи локусов несет индуцированную мутацию, одно из животныхпотомков окажется гомозиготным по этому локусу и будет иметь мутантный фенотип.

Рис. 5.50. Мышь, имеющая мутантный фенотип по одному из семи тестируемых локусов (пегость), вместе со своим отцом дикого типа, матерью из гестерной линии (белая) и гетерозиготными сибсами дикого типа. (Courtesy of Dr. U. Ehling, Neuherberg.)

каждую гомозиготу можно было легко идентифицировать. В качестве примера на рис. 5.50 приводится фотография гомозиготы по одному из этих генов (гену пегости).

Оба метода, использовавшиеся для скрининга генных мутаций, - метод скелетных мутаций и метод множественных локусов - позволяют проводить анализ действия генов на уровне количественных фенотипических признаков (разд. 3.6). Следовательно результаты, важные для количественной оценки генетических эффектов у млекопитающих, не подходят для анализа механизмов индукции мутаций. Кроме того, они дают информацию только об ограниченном числе генных локусов. Однако один из результатов этой работы свидетельствует о том, что частоты мутаций, индуцированных в разных генах, могут обнаруживать значительные различия.

С появлением электрофоретических методов анализа белков, предпринималось большое число попыток применить их для тестирования на мутагенность. С теоретической точки зрения этот подход безупречен. С его помощью можно проводить идентификацию индуцированных мутаций на молекулярном уровне, причем в настоящее время имеются электрофоретические методики для очень многих локусов (разд. 6.1.2). Трудность, с которой встречается исследователь, применяя этот подход, на практике заключается в том, что он требует проведения большого числа соответствующих анализов. Наши, возможно

5 Мутации 233

неточные, оценки частот кодонных мутаций дают величины порядка 10^–8 – 10^–9 на кодон или на аминокислотную замену (разд. 5.1.4.1). Даже если бы частота спонтанных мутаций, выявляемых электрофоретическими методами, на ген составляла 10^–6 – 10^–7, для обнаружения очень небольшого числа мутантов потребовалось бы громадное количество тест-анализов. Эту проблему можно назвать ключевой

Рис. 5.51. Двумерное электрофоретическое разделение растворимых белков из печени плода мыши; часть белкового спектра. Электрофорезу подвергали пробу белков супернатанта после гомогенизации и центрифугирования индивидуальной печени. Разделение белков проводилось в полиакриламидном геле посредством изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) в одном направлении и электрофореза (ПАГЭ) во втором. А. Часть белкового спектра печени плода после обработки самца мутагеном (метилнитрозомочевиной) Необычное белковое пятно отмечено стрелкой. Б Нормальный белковый спектр печени плода из той же самой инбредной линии мышей. (Courtesy of Dr J. Klose, Berlin.)

при создании методик скринирования человеческих популяций на увеличение частоты мутаций. Существует ли какойнибудь способ преодоления этой трудности в экспериментах на животных, кроме приобретения громоздкого и дорогостоящего оборудования для проведения тест-анализов?

Перспективный метод для подобных экспериментальных исследований - двумерное разделение белков с электрофокусированием в одном направлении и электрофорезом в другом, к которому мы вернемся в разд. 6.1.2 [1516]. Высокостабильные спектры, состоящие из нескольких сотен белковых пятен, можно получить, используя экстракты печени инбредных мышей. Точковая мутация может приводить к легко-обнаруживаемому сдвигу одного «пятна» (рис. 5.51). Насколько нам известно, при проведении радиационных экспериментов этот метод еще не применялся.

Тест-системы для соматических мутаций. Для выявления соматических мутаций используют анализ хромосом в культурах лимфоцитов или в костном мозге. Лимфоцитарная система довольно часто применяется в исследованиях на человеке. Это действительно единственная система, позволяющая изучать группы людей, подверженных высокому риску, при минимальных отрицательных последствиях от генетических эффектов, вызванных воздействием мутагенных факторов.

Еще более простая тест-система основана на анализе хромосом, облученных in vitro. При таком тестировании в большинстве случаев использовались культуры лимфоцитов человека. Именно на этой системе было показано, что общие правила индукции мутаций, сформулированные в экспериментальной генетике, применимы и к хромосомам человека (разд. 5.2.1.1). Для некоторых биохимических маркеров разработаны методы выявления точковых мутаций в отдельных клетках, культивируемых in vitro (разд. 5.1.5). Этот метод может быть использован для тестирования на мутагенность. С теоретической точки зрения он представляется очень изящным.

234 5. Мутации

Его разрешающая способность на несколько порядков выше разрешающей способности методов обнаружения генных мутаций in vivo, так как в данном случае объектом (единицей) экспериментального изучения является не особь, а отдельная клетка. Кроме того, мутанты можно клонировать и подвергать всевозможным биохимическим исследованиям. Однако на практике этот метод пока встречается с определенными трудностями. Так, например, селективные системы созданы только для очень небольшого числа биохимических маркеров; некоторые вариантные клетки могут возникать не в результате мутаций, а по каким-то иным причинам; экстраполяция же величин, полученных для очень искусственных условий эксперимента in vitro на ткани живого организма, всегда представляет трудную задачу.