5.1.6.5. Онкогены [1686; 1690, 1691, 1696}

Основные принципы. Выполненные в последние годы молекулярно-биологические исследования и особенно открытие так называемых онкогенов способствовали пониманию молекулярных механизмов канцерогенеза. В ранних работах по слиянию клеток (разд. 3.4.3) было показано, что важную роль в злокачественной трансформации могут играть мутации в определенных локусах и обработка клеток хомячка ДНК вируса полиомы С другой стороны, со времени появления работ Эллермана и Бэнга (1908) и Рауса (1911) стало известно о способности некоторых РНК-вирусов - ретровирусов - индуцировать опухоли у животных. Эти и полученные позднее результаты побудили многих исследователей заняться поиском ретровирусов, которые могли бы вызывать опухоли у человека. До конца 1970-х г. эти поиски были безуспешными. Однако внедрение в практику исследований молекулярно-биологических методов позволило получить в последние годы очень важные результаты.

Показано, что геном ретровируса состоит из одноцепочечной РНК. Он включает следующие информационные последовательности (от 5'- к 3' концу): 5'-регуляторную последовательность; гены, кодирующие белки, необходимые для формирования внутренней структуры; ген обратной транскриптазы; гены поверхностных гликопротеинов; З'-регуляторную последовательность. Как только вирусная частица проникает в клетку, обратная транскриптаза осуществляет синтез двухцепочечной ДНК-копии одноцепочечной РНК. Затем ДНК-копия встраивается в хромосомную ДНК клетки; интеграция может происходить во многих сайтах генома хозяина. Эта ДНК вызывает в клетке синтез новой вирусной РНК и белков, необходимых для синтеза новых вирусных частиц.

Помимо этой минимальной информации геномы онкогенных ретровирусов несут дополнительный ген, являющийся специфическим фактором, вызывающим злокачественную трансформацию хозяйских клеток. Этот ген называется ретровирусным онкогеном (v-onc). В исследованиях по

5. Мутации 215

Таблица 5.23. Локализация протоонкогенов на хромосомах человека [1694]

гибридизации (разд. 2.3) с использованием ДНК-зондов на основе генов v-onc было показано, что такие гены гомологичны генам, находящимся в различных сайтах хозяйского генома. Однако при нормальных условиях они не приводят к злокачественной трансформации. Эти гены называются протоонкогенами или клеточными онкогенами (с-опс). В недавно опубликованном обзоре [1696] упомянуто несколько генов с-опс, которые расположены в различных аутосомах человека (табл. 5.23; см. также табл. П9.5). В настоящее время полагают, что эти гены были интегрированы вирусным геномом на каком-то этапе эволюционного процесса. Однако совершенно неизвестно, почему они вызывают злокачественную трансформацию при переносе в клетку в результате вирусной инфекции и не вызывают таковой, когда передаются как нормальные клеточные компоненты. Три разных гена с-опс расположены в 3, 15 и 20-й хромосомах человека и кодируют три тирозинспецифические протеинкиназы, давая гомологичные по аминокислотным последовательностям генные продукты. Эти протеинкиназы фосфорилируют белки и таким образом влияют на их биологическую активность, что в конечном итоге

приводит к трансформации в результате, например, изменения свойств клеточной поверхности (контактного торможения?). Протоонкогены могут кодировать нормальные факторы роста или их рецепторы. Так, ген sis кодирует одну цепь матрицы, на которой синтезируется фактор роста, а erb-b - матрицу для синтеза рецептора эпидермального фактора роста [1437]. Таким образом, протоонкогены способны через различные факторы роста и их рецепторы контролировать нормальный рост клеток. Можно легко выяснить, как именно мутантные протоонкогены (см. ниже) стимулируют митоз и вызывают рост раковых опухолей. Особый интерес представляет фактор роста, синтезируемый на матрице [1437]. По-видимому, он участвует в образовании атероматозных очагов: предполагается, что они формируются в результате повышенного синтеза нормального фактора роста. Его мутантный аллель sis участвует в образовании неопластической саркомы. Обнаружение связи между генами, кодирующими нормальные факторы роста, и их мутантными аллелями, т. е. онкогенами, индуцирующими опухоли, имеет большое значение для биологии развития и биологии рака [1694]. Существуют структурные различия между v-onc и гомологичными им генами с-опс; так, например, гены с-опс состоят, подобно другим эукариотическим генам, из экзонов и интронов (разд. 2.3), тогда как соответствующие гены v-onc сохранили только экзоны.

Клеточная трансформация. Во многих случаях клеточные онкогены были выявлены путем прямого переноса от трансформированных клеток к нормальным. Обработка пренеопластических фибробластов мышей NIH/3T3 ДНК из опухолегенных клеточных линий в определенной части случаев приводит к появлению трансформированных опухолевых фенотипов в реципиентных клетках. Первый трансформирующий ген, охарактеризованный в трансформантах NIH/3T3 (c-Ha-ras1), был найден в клеточной линии EJ карциномы мочевого пузыря человека. Генетическое повреждение, приводящее к активации, т. е. к появлению трансформирующей способности

216 5 Мутации

онкогена, представляет собой, как было установлено с помощью клонирования, единичную точковую мутацию, обусловливающую замещение одной аминокислоты. Кодон GGC замещается кодоном GTC; трансверсия G  Т приводит при возникновении мутантного белка к замене глицина валином. Однако поиск этого протоонкогена у больных 29 формами рака в ходе анализа с применением ферментов рестрикции не привел к обнаружению случаев носительства; вероятно, данный протоонкоген редок и сопряжен лишь с немногими раковыми болезнями. Интересно, что у вирусной копии этого онкогена из вируса мышиной саркомы выявляется точковая мутация, возникшая в той же самой позиции. Были обнаружены другие случаи активации таких генов в результате единичной точковой мутации. Кроме того, некоторые онкогены, найденные в других опухолях, проявляли структурное сходство с геном c-Ha-ras1. Возможно, что мутантные аллели генов ras причастны к возникновению ≈ 15% опухолей человека.

Из клеточных линий лимфомы Беркитта был выделен трансформирующий ген, имеющий иную структуру (В-lym); продукт этого гена частично гомологичен трансферрину - белку, переносящему железо (см. разд. 6.1.2). В клеточных линиях лимфомы Беркитта обнаружена также перестройка другого гена - с-тус. Тот факт, что в опухоли одного типа найдено два различных онкогена, свидетельствует о том, что иногда для злокачественной трансформации, может быть необходимо возникновение мутаций более чем в одном локусе. Разные стадии канцерогенеза, вероятно, отражают последовательную активацию различных протоонкогенов, приводящую к качественным и количественным изменениям экспрессии генов. В настоящее время идет очень интенсивное изучение механизмов такой активации, поскольку их выяснение обещает прогресс в понимании молекулярных процессов, приводящих к злокачественной трансформации. Согласно исследованиям in vitro, кроме вышеупомянутых точковых мутаций, трансформирующий эффект оказывает присоединение генов с-опс к участкам ДНК, являющимся сильными промоторами или энхансерами, например в результате инсерции таких участков по соседству с генами с-onc. Однако вставка промотора (или энхансера) рядом с онкогеном, возможно, является только одним из необходимых условий трансформации, которая завершается в результате изменений в других протоонкогенах.

Участвуют ли онкогены в канцерогенезе, обусловленном хромосомными перестройками? При рассмотрении результатов изучения онкогенов (особенно данных о том, что инсерция онкогенов рядом с сильными промоторами приводит к их активации) возникает вопрос: может быть при хромосомных перестройках, специфичных для определенных неоплазий (раздел 5.1.6.4), решающую роль играют перемещения онкогенов в области, соседние с промоторно/энхансерными участками (и, возможно, в области, примыкающие к другим регуляторным генам)? Поэтому в настоящее время многие группы исследователей занимаются изучением онкогенов и их активности в опухолях при локализации в нормальных и перестроенных хромосомах (рис. 5.39). При лимфоме Беркитта, например, может происходить 20-кратное увеличение транскрипции гена с-тус [1704]. В плазмацитомах мышей обнаружена транслокация, сходная с той, которая у людей приводит к лимфоме Беркитта, между терминальным участком хромосомы 15, несущим с-тус, и хромосомой 12. Точка разрыва совпадает с константным участком гена тяжелой цепи иммуноглобулина. Сходная ситуация, по-видимому, имеет место в случае лимфомы Беркитта у человека. Онкоген с-abl человека локализуется в терминальном диске длинного плеча хромосомы 9 - в том самом диске, который расположен в точке разрыва, происходящего при транслокации 9:22 (она сопряжена с хроническим миелоидным лейкозом). Пока слишком рано делать окончательные выводы; однако предварительные данные свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что активация онкогенов действительно может играть определенную роль в канцерогенезе, обусловленном хромосомными перестройками Протоонкогены обнаружены также в виде

5. Мутации 217

Рис. 5.39. Ломкие участки хромосом, места локализации онкогенов и локализация хромосомных разрывов при хромосомных аберрациях, приводящих к раку. Схематическое изображение хромосом, содержащих известные ломкие участки; под каждой из хромосом указаны ее номер, локализация ломких мест и онкогенов, типы хромосомных аберраций и сопряженные с ними оаковые заболевания. Треугольники слева от хромосом указывают на диски, несущие ломкие участки ( ) или клеточные онкогены ( ); стрелками справа от хромосом отмечены специфические диски, подвергающиеся транслокациям ( ) или делециям ( ), обнаруживаемым у пациентов, страдающих перечисленными заболеваниями. Дополнительные обозначения ( ) указывают на связь той или иной аберрации с определенной болезнью. ЛБ-лимфома Беркитта; К А - карцинома; ОЛЛ - острая лимфобластическая лейкемия; ОНЛЛ - острый нелимфоцитарный лейкоз; ОМЛ- острый миелоидный лейкоз; ХМЛ- хронический миелоидный лейкоз; ОММЛ- острый миеломоноцитарный лейкоз; ОМОЛ -острый монобластический лейкоз; БК – бластический криз; НХЛ - неходжкинская лимфома; ХЛЛ - хронический лимфолейкоз; ОПЛ – острая промиелоцитарная лейкемия; МПР – миелопролиферативное расстройство. Буквой Р обозначено короткое плечо, a q- длинное плечо хромосомы; t, del и inv - соответственно транслокация, делеция и инверсия [1705].

амплифицированных копий в опухолевых клетках [1694]. Цитологическим проявлением генной амплификации, имеющей место в раковых клетках, являются удвоенные мелкие хромосомы и одинаково окрашивающиеся участки. Онкоген myc, транслоцируемый при лимфоме Беркитта, обнаруживает повышенную экспрессию в случае карциномы легких, карциномы кишечника и промиелоидного лейкоза. Ген N-myc амплифицируется на поздних стадиях развития нейробластомы; высокие уровни фактора роста эпидермиса при сквамозноклеточных карциномах, по-видимому, объясняются амплификацией гена erb-b. Опухолевый рост может быть связан с активностью специфических онкогенов, поскольку в интенсивно растущих формах опухолей обнаруживаются определенные онкогены. Аналоги онкогенов или антионкогенные антитела в противоположность современной химиотерапии рака могут приостановить опухолевый рост без нарушения функционирования нормальных клеток.

Изучение онкогенов - по крайней мере тех, которые известны в настоящее вре-

218 5. Мутации

мя, - конечно, не дает полного ответа на вопрос о механизмах канцерогенеза. Так, в большинстве опухолей человека активированные онкогены не найдены (может быть, потому, что не все онкогены еще известны). К тому же пока совершенно не решен вопрос о том, почему инфицирование ретровирусами, содержащими онкогены, как правило, приводит к злокачественному перерождению только одной определенной ткани. Такие гены должны проявлять строго тканеспецифическую экспрессию. Тем не менее открытие онкогенов было важным шагом на пути к пониманию природы злокачественной трансформации.