5.1.6.4. Другие факты, свидетельствующие о роли соматической мутации в механизме канцерогенеза [1520]

История мутационно-соматической гипотезы возникновения рака. Наследственные синдромы с повышенной хромосомной нестабильностью и дефектами репликации и репарации ДНК можно рассматривать в качестве модели для изучения молекулярных механизмов соматической мутации и образования опухоли. Гипотеза о том, что рак может быть обусловлен соматической мутацией, появилась гораздо раньше работ, посвященных изучению этой проблемы. Еще фон Ханземан (1890) [1475] на основании результатов собственных исследований митоза постулировал, что клетка злокачественной опухоли представляет собой клетку с аномальным содержанием хроматина [77]. Бовери (1914) конкретизировал эту идею, выдвинув предположение о неравном распределении хромосом определенной клетки между ее потомками. Однако он подчеркнул, что здесь существенна аномальная хроматиновая конституция как таковая, а не механизм ее возникновения. В течение последующих десятилетий гипотеза соматических мутаций разрабатывалась многими авторами и обсуждалась в различных аспектах. Наиболее четкие формулировки самых важных следствий из нее дал Бёрнет (1957, 1974) [1408]:

1) новообразования должны быть моноклональными, то есть они должны происходить от одной единственной клетки;

2) их частота может повышаться при действии химических агентов или вирусов, взаимодействующих с ДНК;

3) в отдельных клетках из большой популяции пролиферирующих раковых клеток могут возникнуть дополнительные мутации, обусловливающие дополнительные селективные преимущества; субклоны, ведущие начало от этих клеток, будут быстро перерастать скопления других опухолевых клеток;

4) мутационная гипотеза объясняет также увеличение частоты большинства форм рака с возрастом, если возникновение соматических мутаций можно в качестве первого приближения считать процессом, зависящим от времени. Кроме того, клиническому проявлению клонов должно предшествовать несколько лет их роста.

Мы не будем больше рассматривать здесь индукцию рака химическими веществами, реагирующими с ДНК. Достаточно отметить, что многие мутагены (раздел 5.2.2) оказались и сильными канцерогенами. Злокачественные неоплазии обычно состоят из субклонов, имеющих разные кариотипы, что свидетельствует о множественных аномалиях митозов во время пролиферации опухоли. Увеличение частоты новообразований с возрастом - хорошо известная общая закономерность биологии рака. В настоящее время мы располагаем

208 5. Мутации

многочисленными данными, доказывающими моноклональное происхождение опухолей. Известно, например, что один В-лимфоцит продуцирует легкие цепи углобулина только одного специфического типа - λ или ϰ. Однако разные В-лимфоциты синтезируют легкие цепи, отличающиеся по «вариабельной» части аминокислотной последовательности (разд. 4.4). С другой стороны, при миеломатозе - одном из раковых заболеваний - все эти клетки продуцируют легкие цепи с идентичными вариабельными участками. У женщин, гетерозиготных по двум вариантам гена G6PD, сцепленного с Х-хромосомой (разд. 2.2.3.3), мышечная ткань матки является мозаичной: разные клетки экспрессируют разные варианты фермента, как это и ожидалось на основе предположения о случайной инактивации Х-хромосом. С другой стороны, фиброидные опухоли матки всегда содержат один и тот же вариант во всех клетках. Аналогичные факты известны также и для других опухолей [1519]. Большинство опухолей действительно имеют моноклональное происхождение. Некоторые наследственные опухоли, например нейрофибромы, имеют мультиклональное происхождение, из чего следует, что тенденция к пролиферации свойственна каждой клетке [1449].

Вирусная этиология или соматическая мутация? В настоящее время существует много наблюдений, сделанных главным образом на животных, из которых явствует, что причиной возникновения опухолей могут быть вирусы. Резонно предполагать, что некоторые опухоли человека также имеют вирусное происхождение. Эта гипотеза не противоречит гипотезе соматических мутаций. Вирусы часто бывают сайт-специфическими и могут индуцировать в хромосоме то или иное мутационное событие. Поэтому процесс образования опухоли, следующий за вирусным повреждением, возможно сходен с аналогичным процессом, описанным в случае соматических мутаций любого типа.

Неоплазии, сопряженные с определенными хромосомными аберрациями. Существование единственной специфической хромосомной аберрации, имеющейся только в опухолевой ткани, было описано еще много лет назад для некоторых неоплазии. Классическим примером такой аберрации является филадельфийская (Ph¹) хромосома, которая почти всегда наличествует у больных хроническим миелоидным лейкозом [1584]. При этом заболевании обычно обнаруживают транслокацию почти всего длинного плеча 22-й хромосомы на 9-ю [1478] (рис. 5.35). Такие пациенты имеют нормальные хромосомы во всех тканях, за исключением системы гематопоэза. Фактически же специфическая аномалия хромосом оказывает влияние на все клетки - предшественницы клеток крови, включая мегакариоцитные и эритропоэтические клетки. К аналогичным выводам привело исследование, в котором в качестве биохимического маркера использовали варианты G6PD. Однако клинические и гематологические последствия этой транслокации проявляются только в гранулоцитарных элементах крови; это свидетельствует о том, что данная «мутация», несмотря на ее присутствие в клетках нескольких типов, может влиять на характер роста лишь одной дифференцированной ткани.

В некоторых, составляющих исключение семьях от хронического миелоидного лейкоза умирало по нескольку человек, а в одной семье [1488] несколько ее младших представителей имело в своих гематопоэтических клетках Ph¹-хромосому, не проявляя клинических признаков лейкоза. В этой семье склонность к разрыву 22-й хромосомы наследуется по аутосомнорецессивному типу.

Менингиомы – это опухоли одной из трех оболочек мозга. Они гистологически доброкачественны и в большинстве случаев состоят из гиподиплоидных клеточных линий, в которых отсутствует или имеет делецию одна из хромосом 22. На последующих стадиях образования субклонов возникают изменения других хромосом [1709-1711; 1545].

Разработка нового, высокоразрешающего метода дифференциального окрашивания хромосом (разд. 2.1.2.3), усовершенствование методов приготовления хромо-

5. Мутации 209

Рис. 5.35. Филадельфийская (Ph1) хромосома у больного с хроническим миелоидным лейкозом. А. Транслокация между 22-й и 9-й хромосомами; Аб аберрантная хромосома. Б. Схематическое изображение исходных хромосом и продуктов транслокации [1478].

сомных препаратов из отдельных клеток твердых опухолей позволили обнаруживать специфические хромосомные аберрации во все большем и большем числе других неоплазий [1704]; в большинстве случаев были идентифицированы или делеция полосы (субполосы) или реципрокная транслокация между двумя хромосомами. В табл. 5.21 перечисляются опухоли, для которых идентифицированы специфические транслокации и точки разрыва. Вполне возможно, что аберрации имеются и в тех случаях, когда их не нашли. Просто они могут быть так малы, что не будут выявляться даже с помощью дифференциального окрашивания. Почему же, однако, к селективному преимуществу клетки приводят лишь определенные хромосомные аберрации и почему это преимущество является тканеспецифическим? В последние годы молекулярным биологам удалось найти частичный ответ на первый из вопросов (разд. 5.1.6.6). Но, прежде чем рассказывать об этих результатах, мы рассмотрим один пример, касающийся солидной опухоли.

Ретинобластома (18020). Ретинобластома представляет собой детское офтальмологическое раковое заболевание. Ретинобластома может иметь наследственную и ненаследственную природу [1669; 1676].

210 5. Мутации

Таблица 5.21. Опухоли, сопряженные с известными хромосомными дефектами (по [1704])
Заболевания	Хромосомный дефект	Разрывы или делеции
Лейкозы
Хронический миелоидный лейкоз	t (9; 22)	9q34.1 и 22q 11.21
Острый нелимфоцитарный лейкоз
Ml (острый миелоидный лейкоз)	t (9; 22)	9q34.1 и 22q 11.21
М2 (острый миелоидный лейкоз)	t (8; 21)	8q22.1 и 21q22.3
МЗ (острый промиелоцитарный лейкоз)	t (15; 17)	15q22 и 17q11.2
М4 (острый миело-моноцитарный лейкоз)	inv 16	p13.2 и q22
М4, М5 (острый нелимфоцитарный лейкоз)	t(9; 11)	9p22 и 11q23
Ml, М2, М4, М5, М6 (острый нелимфоцитарный лейкоз)	del 5q	5q22q23
	del 7q	7q33q36
	+ 8
	+ 12
Хронический лимфолейкоз	t (11; 14)	Hql3 и 14q32
Острый лимфолейкоз
L1-L2	t (9; 22)	9q34.1 и 22q 11.21
L2	t(4; 11)	4q21 и 11q23
L3	t (8; 14)	8q24.13 и 14q32.33
Лимфомы
Беркитта, состоящая из небольших неразделившихся клеток	t (8; 14)	8q24.13 и 14q32.33
Фолликулярная, состоящая из небольших разделившихся смешанных и крупных клеток	t (14; 18)	14q32.3 и 18q21.3
Мелкоклеточная лимфоцитарная	+ 12
Мелкоклеточная лимфоцитарная, трансформировавшаяся в диффузные большие клетки	t (11; 14)	11q13 и 14q32
Карциномы
Нейробластома, рассеянная	del 1p	1p31p36
мелкоклеточная карцинома легкого	del 3p	3p14p23
Папиллярная цистоаденокарцинома яичника	t (6; 14)	6q21 и 14q24
Конституциональная ретинобластома	del 13q	13q14.13
Ретинобластома	del 13q	13q14
Аниридия; опухоль Вилмса	del Up	11pl3
Опухоль Вилмса	del 11p	11pl3
Доброкачественные солидные опухоли
Смешанная опухоль околоушной железы	t (3; 8)	3р25 и 8q21
Менингиома	–22	22

Наследственная форма является аутосомно-доминантной с приблизительно 90%-ной пенетрантностью; в разных семьях пенетрантность варьирует [1548]. Приблизительно 68% всех случаев наследственной формы заболевания носят билатеральный характер, остальные - унилатеральный. В некоторых билатеральных случаях во втором глазу обнаружено более одной первичной опухоли [1519-1522]; в унилатеральных случаях, как наследственных, так и ненаследственных, множественное возникновение опухолей обычно не наблюдалось.

Многие пациенты, страдающие ретинобластомой, являются спорадическими больными, т.е. они первые и единственные пораженные в своих семьях. У этой категории больных билатеральное поражение встречается только в ~ 20-25% случаев Спорадические больные принадлежат к одной из двух групп: первая включает тех, болезнь которых обусловлена доминантными мутациями de novo и 50% потомков которых страдает той же патологией, а вторая - больных ненаследственной формой заболевания. Все спорадические больные с билатеральным поражением появились в результате мутаций de novo; сегрегационное отношение для их потомков не

5. Мутации 211

намного ниже 50% [1628]. Из спорадических случаев с унилатеральным поражением около 10-12% возникли вследствие мутаций de novo, а остальные - больные ненаследственной формой. В одной из работ описан ряд следствий для генетического консультирования, вытекающих из этой ситуации [1676] (см., например, приложение 8).

Две мутационные стадии при наследственной форме заболевания. Предполагается, что становление наследственной формы болезни происходит в два этапа. На первом этапе мутирует половая клетка. Эта мутация приводит к таким изменениям хромосомной структуры, которые увеличивают риск возникновения соматической мутации. Мутация в соматической клетке трансформирует одну или несколько измененных клеток в клетки ретинобластомы.

Для возникновения ненаследственной ретинобластомы необходимы, как принято считать, две соматические мутации: на первой стадии клетка может превратиться в потенциальную клетку ретинобластомы; в результате ее состояние может теперь стать идентичным состоянию любой клетки наследственной ретинобластомы. Это означает, что опухоль развивается только в том случае, если за первой стадией следует вторая, возможно эквивалентная одному из этапов, необходимых для становления наследственной формы заболевания.

Еще в 1963 г была описана делеция 13q. Ее обнаружили во всех клетках пациента с билатеральной ретинобластомой и не очень значительными конституциональными аномалиями [1531]. В последние годы, особенно после введения дифференциального окрашивания высокого разрешения, выявлено большое число таких пациентов; у многих из них делетирован или вовлечен в реципрокную транслокацию лишь очень небольшой участок длинного плеча 13-й хромосомы (рис. 5.36). Сравнивая множество подобных фактов, можно установить, что делетированный сегмент приурочен к 13q14 (или даже к 13q14.13; рис. 5.36). «Ген» ретинобластомы (если мы назовем данный участок хромосомы геном) тесно сцеплен с геном эстеразы D (ESD).

В ходе исследований возник другой вопрос: может ли вторая стадия, обусловливающая развитие злокачественного клеточного клона, заключаться в делении хромосомного сегмента в районе 13q14. В этом случае такая делеция должна выявляться во всех опухолевых клетках. По методическим причинам, изучение хромосом опухолевых клеток долгое время представляло определенные трудности; кроме того, клетки солидных опухолей основательно перемешаны с клетками соединительной ткани. Именно этим можно объяснить тот факт, что данные одной старой работы, в которой сообщалось об изменениях сегмента 13q в опухолевых клетках, вскоре после ее появления были опровергнуты. Впоследствии однако вывод о важной роли участка

Рис. 5.36. Делеции у больных с ретинобластомой [1676].

212 5. Мутации

13q14 подтвердился в ходе изучения многих клеток пациентов с наследственной и ненаследственной формами заболевания [1380].

Даже если бы этот вывод оказался справедливым для большинства случаев, это не решило бы проблему проявления мутации лишь в немногих клетках из тех, что ее содержат. Какую-то ясность в этот вопрос могут внести молекулярно-биологические исследования (разд. 2.3) [1389; 1414; 1476] с использованием полиморфизма рестрикционных фрагментов ДНК, тесно сцепленных с геном ретинобластомы. Согласно полученным данным, решающая стадия протекает в гомологичной хромосоме, несущей нормальный аллель. Иногда рестрикционные маркеры, унаследованные от одного из родителей, в раковых клетках полностью отсутствовали, что свидетельствует об исчезновении хромосомы, полученной от этого родителя, и ее замещении второй копией хромосомы, несущей мутантный ген ретинобластомы; в других случаях к тому же следствию - переводу мутации в гомозиготное состояние - приводят рекомбинационные события, в которых принимает участие только часть нормальной хромосомы (рис. 5.37, 5.38). Значение этого результата, по-видимому, выходит за рамки частного случая, при изучении которого он был получен. Такие события, как нерасхождение или рекомбинация, возможно, происходят в соматической ткани гораздо чаще, чем до сих пор предполагалось. С лх помощью можно объяснить различные особенности фенотипов и даже механизм возникновения болезней. В частности, его можно использовать для объяснения других аутосомнодоминантных опухолевых заболеваний.

Генетические синдромы, сопряженные с опухолями. У пациентов с ретинобластомой часто возникает остеосаркома. У таких больных, как и у всех пациентов с ретинобластомой, обнаружена гомозиготность по тому же локусу 13-й хромосомы [1525]. Таким образом, гомозиготность по одному и тому же сайту может быть причиной как ретинобластомы, так и остеосаркомы. В опухоли Вилмса, как и предсказывал Кнудсон, сходные механизмы привели к гомозиготизации одного сайта на 11-й хромосоме, а именно 11р13. У этих больных обнаружен редкий аутосомно-доминантный синдром, характеризующийся аниридией, мочеполовыми аномалиями (гонадобластомой, недифференцированными гениталиями) и умственной отсталостью. Тот же локус, по-видимому, участвует в форми-

Рис. 5.37. Хромосомный механизм, который мог бы привести к гомозиготности по аллелю ретинобластомы (Rb) в соматической ткани гетерозиготы по этому аллелю [1414].

5 Мутации 213

Рис. 5.38. Гомозиготность по аллелю Rb, возникшая в результате митотической рекомбинации (кроссинговера в фазе G2 между двумя из четырех хроматид). ESTD-локус эстеразы D; p7F12, p9D11, pIE8 полиморфные по длине фрагменты ДНК. Крышечка на хромосоме, несущей в локусе Rb аллель дикого типа, изображает гетерохроматиновый маркер, выявляемый при С-окрашивании [1414].

ровании синдрома Беквита - Видемана, который сопряжен с различными эмбриональными опухолями (табл. 5.22). Общий механизм возникновения этих разных опухолей также включает соматическую гомозиготизацию в сайте 11-й хромосомы [1525]. Предполагается, что этот аллельный сайт наследуется от одного из родителей.

Опухолевые заболевания бывают как ненаследственными с возникновением единичных опухолей, так и наследуемыми по доминантному типу с образованием множественных опухолей. Хорошо известно, что такая ситуация имеет место в случае опухолей кожи [1631]: одиночные опухоли обычно ненаследственны, тогда как множественные опухоли того же гистологического типа - доминантно наследуемый признак. В качестве примеров такого рода можно привести нейрофиброматоз и одиночные нейрофибромы, множественные и одиночные липомы, множественные и спорадические кожные лейомиомы, множественные и спорадические клубочковые опухоли, а также синдром базальноклеточного невуса и одиночные базальноклеточные невусы [1391].

Кнудсон представил аналогичные эпидемиологические и статистические данные, свидетельствующие о том, что сходные механизмы могут действовать при образовании многих других опухолей у детей, например нейробластомы и феохромоцитомы. Постулируется существование как спорадических, так и наследственных случаев этих заболеваний. Наследственные случаи чаще носят семейный характер, часто бывают билатеральными, приурочены к более раннему возрасту и характеризуются тем, что опухоль возникает более чем в одном месте (так, например, при нейробластоме – в обоих надпочечниках) [1519; 1522; 1549]. В будущем можно будет локализовать гены, ответственные за возникновение различных сопряженных с опухолями генетических синдромов, путем идентификации хромосомных сайтов, в которых в процессе онкогенеза происходит специфическая по-

214 5. Мутации

Таблица 5.22. Некоторые наследственные синдромы, сопряженные с опухолями
Наследственный синдром	Опухоль	Хромосома
Синдром	Гепатобластома
Беквита - Видемана	Рабдомио-	11р
	саркома
	Опухоль Вилмса
	Адренальная карцинома
Аниридия,	Опухоль Вилмса	11р13
мочеполовые аномалии,
умственная отсталость
Нейрофиброматоз	Астроцитома
	Саркомная трансформация
Множественная эндокринная неоплазия (тип II)	Медуллярный тиреоидный рак
Синдром базальноклеточного не-	Медуллобластома
вуса	Астроцитома
	Рак яичника
	Гамартома

теря конституциональной гетерозиготности. Несколько примеров таких генетических синдромов с указанием сопряженных с ними опухолей дается в табл. 5 22.

«Раковые семьи» известны и в случае других злокачественных опухолей. Данные о карциноме пищевода в семьях, характеризующихся специфическим типом кератодермии ладоней и подошв, обсуждаются в разд. 3.6 (рис. 3.68). Этот пример, как и другие случаи доминантного наследования предрасположенности к возникновению неоплазий, показывает, что в раковых семьях проявляется тенденция к более раннему формированию опухолей в жизни больных, чем при более распространенной спорадически возникающей разновидности того же ракового заболевания. Часто обнаруживается выраженная тенденция к множественному образованию опухолей у одного индивида. Кроме того, эти факты свидетельствуют о генетически детерминированной и доминантно наследуемой повышенной вероятности злокачественной трансформации.