5.1.6.3. Молекулярные механизмы хромосомной нестабильности и образование опухоли, обусловленное соматической мутацией

Пигментная ксеродерма (27870-27875). Хромосомная нестабильность и существование маркерных хромосом при трех синдромах, с нею сопряженных, наводят на мысль, что повторный разрыв хромосом может приводить к образованию клеточных клонов, развивающихся в злокачественные опухоли. В связи с этим возникает вопрос о молекулярном механизме хромосомной нестабильности. Много информации на этот счет дало изучение другой наследственной болезни - пигментной ксеродермы.

После облучения ультрафиолетовым светом на коже больных с пигментной ксеродермой возникает эритема, которая сменяется атрофией и телеангиэктазией (разд. 3.1.3). Постепенно облученные участки становятся бородавчатыми, и на них развивается рак кожи. Из работ на микроорганизмах известно, что клетки имеют ферментативную систему, способную репарировать дефекты ДНК. Ферментативная репарация дефектов, индуцированных ульт-

202 5. Мутации

Таблица 5.19. Распределение групп комплементации у больных пигментной ксеродермой [1450]
Регион, страна	Частота больных в соответствующей группе комплементации								Число пациентов
	А	В	С	D	Е	F	G	вариантная
Северная Америка	3	1	5	5	0	0	0	2	16
Европа и Великобритания	10	0	14	8	2	0	2	5	41
Япония	21	0	1	1	0	3	0	14	40
Египет	7	0	12	0	0	0	0	5	24
Германия	2	0	7	5	0	0	0	9	23
Число обследованных больных	43	1	39	19	2	3	2	35	144

рафиолетовым светом, была хорошо изучена на молекулярном уровне в исследованиях на микроорганизмах. Больные пигментной ксеродермой характеризуются аномально высокой чувствительностью к ультрафиолетовому свету. Клэвер [1036, 1420] показал, что причиной этой болезни является нарушение системы репарации ДНК. Позднее было идентифицировано большое число различных ферментативных дефектов, приводящих к фенотипам, подобным тем, что бывают при пигментной ксеродерме (табл. 5.19).

Механизмы репарации ДНК. В исследованиях на микроорганизмах изучались три основных механизма репарации ДНК: фотореактивация, эксцизионная репарация и пострепликативная репарация (рис. 5.32) [220; 1458].

1. Фотореактивация. Сине-фиолетовый свет увеличивает вероятность выживания бактерии, облученной до этого ультрафиолетовым светом. Летальный эффект ультрафиолетового облучения объясняется образованием тиминовых димеров в ДНК, препятствующих ее репликации. Фотореактивирующий фермент эти димеры расщепляет и восстанавливает таким образом правильную структуру ДНК.

2. Эксцизионная репарация. Второй механизм репарации ДНК - эксцизионная репарация - в свете не нуждается. На первом этапе эндонуклеаза опознает димер и разрезает рядом с ним поврежденную цепь ДНК. Образовавшиеся свободные концы распознаются экзонуклеазами, которые расширяют брешь, отщепляя нуклеотиды. Помимо УФ-индуцированных димеров удаляется до 100 других нуклеотидов. Полимераза осуществляет ресинтез удаленного фрагмента цепи, используя в качестве матрицы неповрежденную сестринскую цепь. Наконец, лигаза «сшивает» вновь синтезированный фрагмент со старой цепью.

3. Пострепликативная репарация. Если фотореактивация и эксцизионная репарация по каким-то причинам невозможны, повреждение в цепи не будет исправлено и она не сможет функционировать как матрица в процессе репликации. Во вновь синтезированной комплементарной цепи ДНК останется брешь. Однако генетическая информация, искаженная образованием димеров, содержится в новой цепи ДНК, синтезированной по старой комплементарной цепи. Эта новая цепь и послужит матрицей, на которой образуется копия, замещающая поврежденную цепь ДНК. Точный механизм этого замещения пока неизвестен; по-видимому, он имеет сходство с нормальными рекомбинационными событиями. Одна неповрежденная цепь ДНК необходима в качестве матрицы как для эксцизионной, так и для пострепликативной репарации.

Ферментативные дефекты при заболеваниях, сходных с пигментной ксеродермой (27870-27880). Показано, что у культивируемых фибробластов больных пигментной

5. Мутации 203

Рис. 5.32. Три механизма репарации ДНК. А. Фотореактивация; тиминовые димеры расщепляются и восстанавливается водородная связь А-Т. Б. Эксцизионная репарация; полухроматидная последовательность, содержащая тиминовый димер, вырезается и синтезируется новая полухроматида. В. Пострепликативная (рекомбинационная) репарация. Полухроматидная последовательность вырезается, репарация происходит после репликации с участием другого продукта деления.

ксеродермой (ПК) сокращается время жизни после ультрафиолетового облучения. Кроме того, выживаемость различных УФ-облученных вирусов, выращиваемых в ПК-клетках, меньше, чем вирусов, культивируемых в нормальных клетках. Отсюда следует, что в хозяйской клетке существует какой-то генетический дефект, не позволяющий ей исправить дефект вирусного генома. Возможно, у нее нарушен один из вышеупомянутых механизмов репарации. Такое предположение подтвердилось в ходе прямого изучения этих механизмов в ПКклетках. Было обнаружено, что клетки разных больных не способны осуществлять эксцизионную репарацию. У них нарушен начальный ее этап - вырезание димеров.

Генетическая гетерогенность [1420; 1421; 1450]. Система эксцизионной репарации включает несколько ферментов, а клинические различия между разными ПК-пациентами свидетельствуют о генетической гетерогенности болезни. Такая гетерогенность обусловлена, по-видимому, тем, что соответствующие мутации могут возникать либо в генах, кодирующих разные полипептидные цепи, либо в различных сайтах одного и того же гена. Один из методов изучения этой проблемы - проведение клеточной гибридизации (разд. 3.4.3) фибробластов от разных больных. Дочерняя клетка, образовавшаяся из двух слившихся клеток, сможет осуществлять эксцизионную репарацию, если ферментативные де-

204 5. Мутации

фекты связаны с разными локусами. В этом случае один геном дает один неповрежденный фермент, а другой - второй фермент, т. е. происходит взаимная компенсация двух дефектов. Если ферментативные дефекты идентичны, то даже при повреждении разных сайтов одного гена, компенсация невозможна. С помощью этого метода было идентифицировано по крайней мере восемь групп комплементации (табл. 5.19). Между группами комплементации существуют клинические различия: так, дополнительные неврологические дефекты, например микроцефалию, прогрессирующую умственную отсталость, замедленный рост и половое развитие, глухоту, атаксию, хореоатетоз и арефлексию, имеют только пациенты групп А, В и D (де Санктис и Каккионе, 1932). Многие ПК-пациенты с неврологическими проявлениями не обнаруживают всего спектра симптомов. Даже внутри одной комплементационной группы может существовать удивительная гетерогенность по степени выраженности неврологических симптомов. У многих больных, которым был поставлен клинический диагноз ПК, эксцизионная репарация оказалась совершенно нормальной. Теперь считается, что они страдают определенной формой ПК. У этих пациентов выявлена недостаточность пострепликативной репарации. Дефекты фотореактивации пока не обнаружены. Кроме того, как показано в табл. 5.19, популяционное распределение этих форм очень неравномерно: например, тип А и вариантный тип распространены главным образом в Японии, тогда как тип С, обычный в популяциях европейского происхождения, в Японии редок.

Злокачественные новообразования у больных пигментной ксеродермой. У пациентов с ПК рано или поздно развиваются множественные злокачественные опухоли кожи. Облучение УФ-светом может приводить к перерождению клеток любого типа. При этом развиваются базальные и сквамозные клеточные карциномы, злокачественные меланомы, кератоакантомы, гемангиомы и саркомы. Образование опухоли можно предотвратить, либо сведя УФ-облучение к минимуму с помощью специальных средств защиты (например, мазей) либо вообще избегая солнечного света.

Повышенный риск возникновения рака у гетерозигот [1340]. Все три синдрома хромосомной нестабильности и пигментная ксеродерма (ПК) наследуются по аутосомно-рецессивному типу. Ферментативная активность у гетерозигот обычно составляет около половины той, что обнаружена у гомозигот по нормальному аллелю (разд. 4.2.2.8). Поэтому имело смысл проверить предположение о возможном увеличении риска возникновения рака у гетерозигот. Наилучшим его подтверждением, которым мы в настоящее время располагаем, могут служить результаты изучения атаксии-телеангиэктазии (А-Т) [1624; 1626]. Это исследование основано на материалах о 27 семьях, объединяющих 1639 близких родственников пробандов с А-Т. Данные о числе случаев рака в этой группе сравнивали с теоретически ожидаемыми для соответствующих контрольных групп (табл. 5.20). Определенное увеличение смертности от рака наблюдается в самой молодой возрастной группе родственников (0 44 года) у представителей разных полов, причем у женщин оно больше, чем у мужчин. Кроме того, у живущих родственников также была обнаружена повышенная частота злокачественных новообразований. При этом выявлено много форм новообразований; как и в случае гомозигот, особенно часто встречались опухоли лимфатической системы, а также карциномы желудка и яичника

Согласно полученной оценке, частота гомозигот по атаксии-телеангиэктазии равна приблизительно 1:40000; соответствующая частота гетерозигот составляет ≈ 1%. В этом случае, как показали расчеты, «гетерозиготы по гену А-Т могут включать более 5% всех индивидов, умирающих от рака в возрасте до 45 лет, и около 2% тех больных, которые умирают от него между 45 и 75 годами». Помимо увеличенного риска возникновения рака, гетерозиготы по гену А-Т могут также иметь несколько повышенную предрасположенность к диабетам, тяжелому сколиозу и дефектам нервной трубки [1624].

Другое исследование предрасположенности к раку проводилось на близких родственниках больных с пигментной ксеродермой. Общего увеличения смертности от рака у них не обнаружено. Однако у этих гетерозигот была повышена частота (не приводящих к смерти) немеланомных опухолей кожи [1316]. Это исследование обобщало данные о 2597 близких родственниках ПК-пациентов из 31 семьи, проживающей в США. Представляется довольно интересным, что увеличение частоты случаев заболевания тс-

5. Мутации 205

Таблица 5.20. Смертность гетерозиготных индивидов от злокачественных опухолей [1624]

ми или иными формами рака кожи обнаружено только у жителей южных штатов США, где много солнечного света. Этот факт вместе с отрицательными результатами, полученными для всех других форм рака, кроме карцином кожи, свидетельствует о специфическом дефекте системы репарации УФ-повреждений в эпителиальных клетках, проявляющемся только тогда, когда кожа подвергается сильному облучению солнечным светом, то есть отмеченное увеличение частоты является, так сказать, экогенетическим феноменом (разд. 4.5.2).

С другой стороны, в случае анемии Фанкони тщательный анализ имеющихся данных не выявил сколько-нибудь заметного повышения риска возникновения рака у гетерозигот.

Молекулярные механизмы синдромов с повышенной хромосомной нестабильностью. Образование тиминовых димеров происходит только в одной из двух сестринских цепей ДНК. Поэтому оно не приводит к немедленному появлению хромосомной бреши или разрыва. Однако если димер не может быть вырезан, цепь, в которой он находится, не будет функционировать в качестве матрицы в ходе следующей репликации, комплементарная ей цепь ДНК окажется неполной и во втором цикле репликации появится видимый разрыв (рис. 5.33). Следовательно, если брешь в двойной цепи ДНК связана с видимыми в микроскоп хромосомными разрывами, следует ожидать большего увеличения числа хромосомных разрывов после облучения ПК-клеток, чем нормальных клеток. Такое увеличение действительно было описано. С другой стороны, в необлученных ПК-клетках нестабильности хромосом не наблюдалось. Этим они отличаются от клеток больных с анемией Фанкони, синдромом Блума и атаксией-телеангиэктазией. Эти заболевания всегда сопровождаются спонтанной хромосомной нестабильностью. Следовательно, молекулярные дефекты, лежащие в их основе, различны. Разумно, однако, предполагать, что определенные нарушения механизмов репликации и репарации ДНК также могут быть в числе факторов, приводящих к возникновению этих синдромов. Некоторые данные подтверждают сделанный вывод.

Однако, несмотря на все предприни-

Рис. 5.33. Дефект эксцизионной репарации. Если тиминовые димеры, образовавшиеся в результате облучения УФ-светом, не вырезаны, такие цепи не могут функционировать в качестве матриц в следующем репликационном цикле. Это приводит к разрыву хромосомы. А. Образование димера. Б. В ходе первой репликации встраивание комплементарных оснований против тиминового димера не происходит. В. Вторая репликация: ее результатом является разрыв структуры ДНК в одном из продуктов деления.

206 5. Мутации

мавшиеся усилия, глубоко разобраться в молекулярных основах этих синдромов до сих пор не удалось. Для их объяснения предложено много разных механизмов. Их связывают с дефектами различных ферментов репарации, пониженным содержанием кофакторов ферментов, аномальным транспортом ферментов, необходимых для репликации ДНК (например, топоизомеразы) через ядерную мембрану или недостаточными энергетическими запасами. Были установлены некоторые интересные факты, по-видимому, важные в функционировании такого механизма, например замедление роста цепи ДНК при синдроме Блума. Однако главные, определяющие дефекты пока неизвестны. Их выявление имело бы важное значение, так как эти синдромы служат моделями как при выяснении молекулярных механизмов спонтанных мутаций вообще, так и молекулярных механизмов соматических мутаций, связанных с новообразованиями, в частности. Цепь событий при образовании злокачественных неоплазий, возникающих в результате соматической мутации [1633]. Цепочка событий, приводящих к образованию неоплазий, обусловленных соматической мутацией, изображена на рис. 5.34. Первый этап - повреждение ДНК. Оно может быть вызвано или внутренними факторами, например нарушением механизмов репликации или репарации, или внешними, например ионизирующей радиацией, химическими мутагенами или вирусами. Повреждение ДНК способно полностью вывести из строя репликацию и поэтому может быть летальным. Другая возможность заключается в том, что повреждение будет репарировано, но с ошибкой. Здесь не имеет принципиального значения, какого типа мутации при этом образуются. На-

Рис. 5.34. Развитие злокачественной опухоли. Соматическая мутация, например хромосомный разрыв, может привести к образованию клона клеток, обладающих селективным преимуществом. Этот клон может постепенно развиться в злокачественную опухоль [1633].

5 Мутации 207

пример, это может быть точковая мутация, возникшая в результате замены одного основания, или видимая хромосомная аномалия. Мутация может оказаться летальной и привести к гибели несущий ее клеточный клон. Другая возможность заключается в том, что клетки, содержащие мутацию, будут расти нормально; в этом случае единственным индикатором мутаций окажется маркерная хромосома. Наконец, не исключена вероятность того, что новый клеточный клон будет обладать селективным преимуществом, обусловленным генетическими дефектами нормальных механизмов торможения и регуляции роста. В этом случае развивается рак. Причиной возникновения опухоли могут быть и вторичные генетические процессы, например образование дополнительных анеуплоидий. В некоторых случаях они вызывают гибель клеток, а иногда приводят к появлению клонов, имеющих селективное преимущество. Неконтролируемый рост новообразования продолжается до тех пор, пока больной не погибнет от нарушения нормальной жизнедеятельности. Мысль о том, что хромосомы могут играть какую-то роль в возникновении опухолей, высказывалась еще в начале нашего века Бовери (1914, см. [77]). Доказать эту гипотезу удалось лишь после появления тонких цитогенетических методов.