5.1.5. Изучение генных мутаций в отдельных клетках

В свете успехов генетического анализа микроорганизмов представлялось многообещающим изучение проблем генетики человека на отдельных клетках. Развитие этого подхода описано в разд. 4.2.2.1. Принимая во внимание низкую частоту спонтанных мутаций и методические сложности, затрудняющие изучение популяционных выборок, размер которых был бы достаточен для получения даже грубой оценки на уровне индивида, можно было предположить, что реализация подхода на уровне отдельных клеток увеличила бы разрешающую способность генетического анализа на несколько порядков.

Попытка изучения мутаций in vivo. Этвуд и Шейнберг [1378] разработали метод, позволяющий удалять из образца крови путем агглютинации с анти-А сывороткой все те клетки,

194 5 Мутации

которые реагируют с этой анти-А сывороткой, оставляя в нем только нереагирующие клетки. У пробандов, имеющих группу крови АВ, было найдено некоторое количество клеток, неспособных к агглютинации. Согласно предложенной интерпретации, эти клетки потеряли антиген А, сохранив антиген В Относительная частота этих клеток у различных индивидов изменялась от 0,5 до 10,9/1000 клеток. Согласно гипотезе, эти клетки являются соматическими мутантами. Однако масштабы феномена делают такую интерпретацию маловероятной Кроме того, результаты дополнительного иммунологического изучения данной системы порождают серьезные сомнения в мутационном происхождении клеток, не способных к агглютинации Несмотря на то что попытка изучения мутационного процесса in vivo успеха не имела, она по-прежнему представляет интерес.

Центральной проблемой мутационных исследований, проводимых на отдельных клетках, остается вопрос о том, действительно ли клетки, проявляющие аберрантный по биохимическим или иммунологическим признакам фенотип, являются мутантами de novo или только продуктами некоего вторичного изменения, не влияющего на генетический материал. Предпринятые недавно повторные попытки выявления гемоглобиновых вариантов в отдельных эритроцитах оказались успешными [1642].

Изучение мутантных клеток in vitro. Методы культивирования нормальных диплоидных клеток человека in vitro описаны в разделе 4.2.2.1 [1418]. Одна из главных трудностей, возникающих при изучении мутационного процесса в таких клетках, связана с его низкой эффективностью. Для выделения очень немногих мутантных клеток из гораздо большего числа нормальных требуются специальные методы селекции. Принцип, лежащий в их основе, описан в разд. 4.2.2.6 на примере синдрома Леша—Найхана, обусловленного дефектом фермента гипоксантин-гуанин—фосфорибозилтрансферазы (HPRT). Вместо гипоксантина к исследуемым клеткам добавляют 8-азагуанин, который, связавшись с нормальным ферментом, обусловливает гибель клеток. Выживут только те из них, которые неспособны превращать это соединение из-за дефекта HPRT.

Имеются и другие селективные системы, применяемые, например, в случаях галактоземии, цитруллинемии и оротикацидурии. Предложен многообещающий подход, при котором эритроциты, содержащие гемоглобиновые варианты, возникшие в результате предполагаемой соматической мутации, идентифицируются с помощью специфических антител, полученных против определенных вариантных гемоглобинов.

Как отмечалось выше, вариант, выделенный в клеточной культуре, не обязательно возникает вследствие истинно генетического, наследуемого изменения. Для подтверждения мутационной природы требуются по крайней мере два критерия.

1. Доказательство стабильности селектированного фенотипа.

2. Положительные результаты флуктуационного теста Луриа и Дельбрюка [1538], основанного на принципе, согласно которому при сравнении большого числа микробиологических культур многочисленные мутантные клетки будут иметь лишь очень немногие из них (мутация произошла на ранних стадиях развития культуры), тогда как большинство культур будут содержать очень мало мутантных клеток (мутационное событие произошло на поздних стадиях). Во многих культурах мутантных клеток вообще не будет (рис. 5.27). Методы определения частоты спонтанных мутаций основаны именно на флуктуационном тесте; на рис. 5.27, В, например, каждая колония представляет собой мутантный клон, произошедший из одной клетки.

В табл. 5.17 приведены оценки частоты спонтанных мутаций для локуса HPRT. На первый взгляд эти частоты имеют тот же порядок, что и частоты мутаций в половых клетках человека, рассчитанные для наследственных болезней по фенотипическим признакам (табл. 5.8). Однако последние получены на смещенной выборке признаков, являющихся конечным результатом нескольких десятков клеточных делений. Поэтому сравнение с частотами мутаций в соматических клетках не имеет большого смысла.

В работе с использованием системы HPRT было обнаружено, что в фибробластах двух больных с синдромом Блума частота спонтанных мутаций выше (до 19 — 23 х 10^–6), чем в нормальных фибро-

5. Мутации 195

Рис. 5.27. Иллюстрация принципа, положенного в основу флуктуационного теста Луриа и Дельбрюка [1538]. Если клеточное деление носит дихотомический характер, в первом поколении после начала деления будет 21 = = 2 клетки; во втором – 22=4 клетки; в третьем поколении 23 = 8 клеток и т. д. Если все изучаемые культуры клеток берут начало от одной-единственной клетки и если частоты мутаций одинаковы во всех клеточных поколениях, можно рассчитать относительное число культур с 0, 1,2,... мутантными клетками, зависящее от того, в каком клеточном поколении произошла мутация. Например, если мутация возникла в первом делении, половина всех клеток будут мутантными (А). В этом случае риск мутирования существует только для одной клетки. С другой стороны, если мутация происходит в делении, непосредственно предшествующем изучению данной культуры, мутантной окажется одна-единственная клетка (Б). Однако в случае такой мутации риск мутирования существует для 2n–1 клеток, где n - число клеточных поколений. (В). Ожидаемое распреде пение мутантов в культурах.

бластах (4,6 – 4,9 х 10^–6) [1688]. Синдром Блума представляет собой синдром хромосомной нестабильности; следовательно, соответствующий ген является одним из генов-мутаторов человека. Повышенная частота мутаций была выявлена в исследованиях in vivo.

Увеличение мутационной частоты нашло подтверждение при изучении лимфоцитов больных с синдромом Блума и с другими синдромами хромосомной нестабильности [1666; 1666а]. Вот соответствующие цифры:

Нормальные контрольные клетки: 2,0 — 4,4 х х 10–4

Синдром Блума (7 пациентов): 8,5 — 24,9 х х 10–4

Анемия Фанкони (2 пациента): 20,0 — 22,6 х х 10–4

Атаксия-телеангиэктазия 8,5 х 10–4 (1 пациент):

Таблица 5.17. Частота спонтанных мутаций устойчивости к 8-азагуанину в клетках человека и китайского хомячка [1683]

1 96 5. Мутации