4.7. Генетика эмбрионального развития

Результаты исследований по биохимической и молекулярной генетике многое прояснили в структуре генов, а также в генетическом контроле работы ферментов и других белков. В то же время наши знания о генетических основах эмбрионального развития нельзя назвать удовлетворительными. Поэтому, хотя о дефектах ферментов известно достаточно много, биохимические основы морфологических аномалий в большинстве случаев остаются невыясненными,

4 Действие генов 127

несмотря на успехи в выяснении биохимической природы доминантных заболеваний (разд. 4.6). Генетика развития по-прежнему остается белым пятном на карте молекулярной генетики.

Как и во многих других областях молекулярной биологии, в генетике развития зачастую в качестве экспериментальных моделей используются животные, поскольку эксперименты на человеке невозможны. В книге, посвященной генетике человека, трудно охватить всю эту область. Здесь будут описаны лишь основные направления с привлечением конкретных данных, полученных на человеке. Генетика развития базируется на концепции развития, расцвет которой пришелся на первое десятилетие нашего века.

4.7.1. Активность генов в раннем развитии

Эмбриональное развитие удобно подразделять на две фазы: раннюю, включающую оплодотворение и несколько первых делений зиготы вплоть до образования гаструлы, и позднюю, на которой закладывается форма тела и развиваются органы. Результаты последних исследований экспрессии генов и ее регуляции в раннем развитии, полученные сначала на примитивных организмах, а впоследствии на млекопитающих, могут быть экстраполированы на человека [49; 1207].

1. Главной генетической проблемой эмбрионального развития является дифференцировка. До сих пор непонятно, каким образом группы клеток приобретают различные функции, несмотря на то, что их геномы идентичны. В настоящее время теории дифференцировки на уровне генов можно считать опровергнутыми. Действительно, геномы всех клеток организма, за отдельными исключениями, идентичны. В классическом эксперименте, проведенном на лягушках, удалось показать, что в результате трансплантации ядра клетки кишечника в безъядерное яйцо происходит развитие полноценного организма. Подобные эксперименты были осуществлены позднее и на мышах. Кроме того, гены гемоглобина были выделены из различных типов неэритропоэтических тканей - фибробластов и лимфоцитов (разд. 4.3). Контроль дифференцировки на уровне ДНК продемонстрирован для иммуноглобулинов. Весьма возможно, что это не единственное исключение (разд. 4.4). Однако, как правило, контроль дифференцировки осуществляется на транскрипционном уровне: дифференцированные клетки производят различные наборы мРНК. Возможна также регуляция на других уровнях, меньше связанная с первичной активностью гена. Точный механизм такого контроля для высших эукариот не установлен, однако предполагают, что он может быть связан со структурой хромосом (разд. 2.3).

2. Число различных мРНК, транслируемых в раннем эмбриональном развитии, достаточно велико, их набор изменяется в зависимости от стадии развития. Вероятно, для раннего эмбрионального развития требуется работа большого числа генов.

3. У иглокожих ранние стадии развития до или даже после гаструляции контролируются большей частью или исключительно материнским геномом. В зиготе имеется пул материнских мРНК, которые и обеспечивают этот контроль. Более того, тРНК и рибосомы – также материнского происхождения. Различные части отцовского генома начинают работать не строго одновременно.

В исследованиях, проведенных на мышах, были получены несколько иные результаты [1070; 1208]. Преимущество этой экспериментальной системы заключается в том, что в распоряжении ученых имеется много генетических линий как нормальных, так и аномальных мышей. Это позволило использовать современные аналитические методы и генетическое маркирование. Например, требуется выяснить, на какой стадии начинается экспрессия генов эмбриона. Установлено, что синтез РНК начинается уже на стадии двух клеток, однако это еще ничего не говорит о синтезе белка. Эту проблему мы сумеем решить, если научимся (с помощью генетических маркеров) различать транскрипцию отцовского и материнского геномов. Появление у зародыша отцовских маркерных признаков указывает самую позднюю возможную стадию, на которой начинается экспрессия генов самого эмбриона. (Впрочем, не исключено, что транскрипция с материнского генома начинается раньше). Такие отцовские маркеры, как HPRT (разд. 4 2.2 6)

128 4 Действие генов

или антиген HY, появляются на стадии 8 клеток, β-галактозидаза и β-глюкозидаза - на стадии 4, а синтез макроглобулина включается на стадии двух клеток (рис. 3.39). Более того, продемонстрировано, что оба сцепленных с Х-хромосомой гена HPRT (из обоих геномов) функционируют до ее инактивации (разд. 2.3.3.3). Поэтому соответствующая ферментативная активность у самок вдвое выше. Сложность такого рода опытов связана с определением пола. Впрочем, существует и альтернативный подход, состоящий в искусственном получении монозиготных близнецов. Зародыш на стадии двух клеток вымывают из фаллопиевых труб, клетки отделяют друг от друга и каждую из них выращивают в культуральной среде. В результате получают два генетически тождественных зародыша, один из которых используют для биохимического изучения, а другой для кариотипирования.

Даже если геном эмбриона начинает экспрессироваться на стадии двух клеток, это еще не означает, что такая экспрессия необходима для нормального развития. Решению этого вопроса может помочь анализ генетических вариантов с аномалиями развития. Доминантная мутация олигосиндактилии обусловливает аномалии формирования конечностей и почек, у гомозигот по такой мутации развитие останавливается на шестом делении зиготы Метафазы при этом похожи на метафазы клеток, обработанных ингибитором митоза колцемидом. Дефект образования веретена, приводящий к накоплению метафазных клеток, был обнаружен уже на стадии бластоцисты, следовательно, уже на этой стадии необходима работа определенной части генов зиготы.

Одинаков ли вклад материнского и отцовского генотипа в фенотип потомства? Как уже отмечалось, отцовский генотип начинает функционировать в раннем развитии, что, однако, не обязательно означает равный вклад материнского и отцовского геномов в развитие зародыша, особенно если учесть, что зигота содержит большое количество материнской РНК. Действительно, некоторые биологические явления позволяют предполагать больший вклад материнского организма. Например, потомок от спаривания лошади и осла – мул – гораздо меньше похож на осла, чем потомок коня и ослицы.

У человека, как правило, слишком сложно количественно оценить признаки, которые можно сравнивать у детей и обоих родителей. Однако имеются некоторые данные (полученные с помощью семейного анализа), которые свидетельствуют в пользу большего сходства в строении пальцев, кисти и стопы у детей и их матерей, чем у их отцов [1169; 1279]. Заметим, что интерпретировать подобные результаты не просто.

Тератокарцинома мышей как инструмент исследования раннего развития [1140]. Возможности биохимического исследования ранних стадий развития млекопитающих на клеточном уровне сильно ограничиваются недостаточным количеством материала. Многие важные события дифференцировки происходят, когда соответствующих клеток еще очень мало. Кроме того, клетки, находящиеся на различных стадиях дифференцировки, располагаются очень близко друг к другу. Недавно появилась возможность преодолеть некоторые из этих затруднений благодаря использованию клеток тератокарциномы мышей. Тератокарцинома яичников или семенников мышей возникает спонтанно или может быть индуцирована во многих инбредных линиях мышей Опухоли состоят из разнообразных тканей, происходящих из трех зародышевых слоев. Кроме того, эмбрионоподобные злокачественные клетки демонстрируют инфильтративный рост Однако их дифференцированные варианты не являются злокачественными.

Клетки тератокарциномы можно получить в культуре; такие культуры способны расти и дифференцироваться в различные ткани. Получено множество линий эмбрионоподобных клеток; если их инъецировать мышам, возникают опухоли, в состав которых входят различные типы дифференцированных клеток. Такие клетки во многом похожи на нормальные зародышевые клетки и при этом доступны в большом количестве. Поэтому их можно использовать в качестве модельных систем для изучения дифференцировки Например, они смешиваются с нормальными зародышевыми клетками, если их инъецировать в 4-дневную бластоцисту, что приводит затем к образованию генетических мозаиков.

В культуре легко получить большие количества гомогенных клеток, происходящих из тератокарциномы, на определенной стадии дифференцировки Такие клеточные популяции могут быть использованы для биохимического анализа, результаты которого сопоставимы с данными, полученными на эмбрионе. Показано, что большинство классов мРНК являются общими для зародышевых клеток и предшественников клеток крови (миелобласгов), тогда как глобиновая мРНК обнаруживается в миелобластах, но не обнаруживается в зародышевых клетках. Кроме того, установлено, что обе Х-хромосомы в клональных культурах недифференцированных клеток самок генетически активны; инактивация одной из Х-хромосом происходит, когда начинается дифференцировка [885]. Особенно удобна данная система для исследования роли поверхностных клеточных антигенов в дифференцировке В разд. 3.5.5 при обсуждении главного комплекса гистосовместимости (МНС) указывалось,

4. Действие генов 129

что такие антигены могут выполнять определенную функцию в дифференцировке клеток. Обнаружено, что клетки раннего эмбриона совершенно лишены антигена МНС Н-2 (он соответствует человеческому HLA); впрочем, в этих клетках имеются другие антигены, например F-9. Он утрачивается, когда ранние эмбриональные клетки дифференцируются в фибробласты, миобласты и другие типы клеток, для которых характерно наличие Н-2 антигена. У взрослых животных антигены F-9 можно обнаружить только в сперматогониальных элементах. По-видимому, они имеют отношение к комплексу генов T/t. Некоторые аллели этой системы нарушают нормальное эмбриональное развитие, вызывают его остановку на определенных стадиях. F-9 играет также определенную роль в образовании морулы. Этот вывод был сделан на основании того, что образование морулы, обычно нормально протекающее в культуре, можно предотвратить специфическими моновалентными aнти-F-9-антителами. Дробление клеток происходит правильно, это свидетельствует против неспецифического токсического эффекта. По-видимому, антитела ослабляют клеточные взаимодействия и тем самым нарушают компактность морулы и ее переход в бластоцисту. Ранее, в разд. 4.2.2.6, обсуждалась метаболическая кооперация HPRT⁺и HPRT-фибробластов в культуре. Подобная метаболическая кооперация наблюдается и между клетками раннего эмбриона; она подавляется анти-Р-9-антителами.

Использование тератокарциномы мышей в изучении дифференцировки представляет собой пример распространенной стратегии: если определенная проблема слишком сложна, для ее решения следует прибегнуть к упрощенной экспериментальной модели. Возможно, благодаря этому мы все-таки сможем ответить на один из основных вопросов генетики развития: почему генетически идентичные клетки становятся фенотипически различными?