Ход работы.

1. В первые 3 пробирки помещают стандартные растворы с содержанием белка 5, 10 и 15 мг в 1 мл. Эти пробирки служат для построения ка­либровочной кривой. В 4-ю пробирку наливают раствор с неизвестной концентрацией белка, которую нужно опре­делить.

2. В каждую пробирку добавляют по 4 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин для раз­вития окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на ФЭКе в кюветах с толщиной слоя 1 см, пользуясь зе­леным светофильтром (длина волны 540 нм). В качестве контрольного раствора при измерении на ФЭКе исполь­зуют биуретовый реактив.

3. Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрации стандартных растворов белка, а на оси ординат - соответствующие значения оптической плотности. Зная оптическую плотность раствора белка с неизвестной концентрацией, по калибровочной кривой определяют в нем содержание белка.

Записывают принцип метода; зарисовывают калибро­вочный график зависимости оптической плотности от концентрации стандартного раствора белка. Пользуясь этим графиком, рассчитывают содержание белка в испы­туемом растворе и записывают результат.

Тема 3

ФЕРМЕНТЫ

(4 ч)

Работа 7. Ферменты как биологические катализаторы.

Ферменты, энзимы – специфические белки всех живых клеток, играющие роль биологических катализаторов. С их помощью осуществляется обмен веществ и энергии в организмах.

Свойства ферментов

1. Все ферменты белковой природы (простые и слож­ные).

2. Все ферменты характеризуются термолабильностью, т. е. оптимум дей­ствия 0°- 45°С.

3. Ферменты специфичны; различают абсолютную и от­носительную специфичность.

4. Ферменты действуют в мягких условиях среды, с определенным значением рН.

5. Ферменты обладают высокой каталитической актив­ностью (например, холинэстераза за 1 сек расщепля­ет 300000 молекул ацетилхолина).

Исследуемый материал: раствор слюны.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 50 мл, цилиндрические маленькие пробирки 15 шт, стеклянные палочки, штатив для пробирок, химический стакан, пробиркодержатель, спиртовка, спички.

Реактивы: 1) 1% раствор крахмала, 2) 10% раствор NaOH, 3) 1% раствор CuSO₄, 4) фосфатный буфер, 5) 1% раствор NaCl, 6) водный раствор I₂ в КI.

Ход работы

Для исследования активности амилазы слюны и ее свойств используют собственную слюну, разведенную в 10 раз. Для этого в мерную пробирку собирают 1 мл слюны (предварительно полость рта ополаскивают водой) и доводят до метки 10 мл.

Опыт 1. Определение термолабильности амилазы слюны.

Реагенты, условия опытов	Количество реагента, капель
	Опыт А	Опыт Б	Контроль
Раствор слюны	10	-	-
Кипяченая слюна (кипятить 2 мл раствора слюны 5-8 мин, охладить)	-	10	-
Вода	-	-	10
Крахмал	10	10	10
Термостат, 38ºC, 10 мин
Реакция с иодом (5 капель раствора из пробирки + 1капля I2 в КI), окраска
Реакция Троммера (5 капель раствора из пробирки + 5 капель 10% NaOH + 3 капли 1% CuSO4, кипятить 1 мин), окраска
Вывод:

Опыт 2. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции.

Реагенты, условия опытов	Проба 1	Проба 2	Проба 3	Проба 4
Крахмал, мл	1	1	1	1
Раствор слюны, мл	1	1	1	1
Температура, ºC	0	20	40	100
Инкубировать 10 мин и затем добавить по 1-2 капли I2 в КI
Зарегистрировать окрашивание

Опыт 3. Определение оптимума рН для действия амилазы.

Условия опытов Реагенты	Значение рН
	6.0	6.4	6.8	7.2	7.6	8.0
Буферный раствор, мл	2	2	2	2	2	2
Крахмал, 0,5%, мл	1	1	1	1	1	1
Раствор слюны, мл	1	1	1	1	1	1
Термостат, 38ºC, 10 мин
Раствор I2 в КI, капель	1	1	1	1	1	1
Окраска
Вывод:

Опыт 4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы.

Реагенты, условия опытов	Количество реагента
	Проба 1	Проба 2	Контроль
Раствор слюны, мл	1	1	1
Вода, капель	-	-	2
NaCl, капель	2	-	-
CuSO4 , капель	-	2	-
Крахмал, капель	5	5	5
Экспозиция, 5 мин
Раствор I2 в КI, капель	1	1	1
Результат, окраска
Вывод:

Работа 8. Свойства ферментов

Исследуемый материал: раствор слюны, срезы клубней вареного и сырого картофеля.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 50 мл, цилиндрические маленькие пробирки 10 шт, стеклянные палочки, штатив для пробирок, химический стакан, пробиркодержатель, спиртовка, спички.

Реактивы: 1) 1% раствор крахмала, 2) Феллингова жидкость, 3) 1% раствор сахарозы, 4) гваяковая настойка, 5) NaI (порошок), 6) NaCl (порошок), 7) КClO₃ (порошок), 8) фильтрат дрожжей.

Ход работы

Опыт 1. Специфичность действия ферментов

Для действия ферментов характерна специфичность: а) абсо­лютная — фермент катализирует превращение строго определенного вещества (уреаза расщепляет только мочевину на СО₂ и NH₃); б) относительная — фермент катализирует превращения одного типа свя­зей в ряду близких по химическому строению веществ (например, липаза катализирует разрыв сложноэфирных связей независимо от типа радикала); в) групповая относительная — то же, но для разрыва связи важны образующие ее атомные группировки. Все протеолитические ферменты расщепляют пептидные связи, но пепсин, трипсин и химотрипсин расщепляют пептидные связи, образованные только определенными аминокислотами; г) стереохимическая — фермент катализирует превращение только одного стереоизомера при наличии рацемата (L-оксидазы превращают L-аминокислоты, но не D-аминокислоты).

Приготовить раствор слюны - 1мл слюны + 4 мл воды.

Реагенты, условия опытов	Количество реагента, капель
	Проба 1	Проба 2	Проба 3	Проба 4
Раствор слюны	5	5	-	-
Фильтрат дрожжей	-	-	5	5
Крахмал	10	-	10	-
Сахароза	-	10	-	10
Термостат, 37ºC, 10 мин
Реакция Феллинга (по 5 капель раствора из каждой пробирки+3 капли реактива Феллинга, кипятить 1 мин), окраска
Вывод:

Опыт 2. Исследование свойств фермента тирозиназы из картофеля.

Тирозиназа – фермент, окисляющий аминокислоту тирозин в темный пигмент за счет кислорода. Этот фермент может окислить и гвоякову смолу. В результате образуется озонид синего цвета.

Реагенты, условия опытов	Срез сырого картофеля	Срез вареного картофеля
Гваяковая настойка, капель	1	1
Результат
Вывод

Опыт 3. Ингибирующее действие хлорид-ионов на дегидрогеназный комплекс картофеля.

Хлорид-ионы ингибируют дегидрогеназный комплекс и в их присутствии поверхность среза картофеля остается без изменений; в остальных случаях она - темнеет.

Срезы клубней картофеля	Нанесение порошка	Результат, окраска (15-20 мин)	Вывод
1	-
2	NaCl
3	NaI
4	КClО3

Тема 4

ВИТАМИНЫ

(8 ч)

Работа 9. Качественные реакции на витамины.

Витамины — это низкомолекулярные органические соединения различной химической природы, необходимые для осуществления жизненно важных биохимических и физиологических процессов в живых организмах. При этом витамины не используются для пластических и энергетических нужд организма. Человек в сутки потребляет око­ло 600 г пищи (в пересчете на сухое вещество), из этого количества на долю витаминов приходится 100-200 мг. В настоящее время существует несколько номенклатур витаминов: 1) по предложению Э. Мак-Коллума (1913 г.), их обозначают латинскими буквами А, В, С, D, Е, К и др.; 2) наименование по физиологическому действию — к названию болезни, которую предупреждает или излечивает витамин, до­бавляется приставка aнmu- (антискорбутный, антигеморрагический, антистерильный и др.); 3) химическое наименование.

В 1974 г. принята временная классификация витаминов.

Витамины, растворимые в воде: В₁ — тиамин, антиневротичес­кий; В₂ — рибофлавин, витамин роста; В₃ — пантотеновая кислота, антидерматитный; В₅ (РР) — никотиновая кислота, антипеллагрический; В₆ — пиридоксол, антидерматитный; В₁₂ — цианкобаламин, антианемический; В_с — фолиевая кислота, антианемический; Н -биотин, антисеборейный; С — аскорбиновая кислота, антискорбут­ный; Р — рутин, капилляроукрепляющий.

Витамины, растворимые в жирах: А — ретинол, антиксерофтальмический; D — кальциферол, антирахитический; Е — токоферол, антистерильный; К — филлохинон, антигеморрагический;

Витаминоподобные вещества: холин, липоевая кислота, оротовая кислота, витамин В₁₅, инозит, ПАБК (парааминобензойная кисло­та), карнитин, витамин U.

Биологическое действие большинства витаминов сводится к уча­стию их в ферментативных реакциях в качестве кофакторов фермен­тов (коферментная функция). Для витаминов, растворимых в воде, известны антивитамины. Это аналоги витаминов, которые оказывают противоположное витаминам действие (например, антивитами­ном тиамина является окситиамин). Среди жирорастворимых вита­минов антивитамины известны только к витамину К — производные кумарина (дикумарин, варфарин, тромексан).

Недостаточное поступление витаминов с пищей вызывает забо­левания, называемые гиповитаминозами. При отсутствии одного из витаминов в пище развивается авитаминоз, при недостатке несколь­ких — полигиповитаминозы, а при их отсутствии в пище — полиави­таминозы. При чрезмерном введении витаминов (как правило, жи­рорастворимых) могут развиваться гипервитаминозы.

Исследуемый материал: фармакопейные препараты витаминов А, С, Е, D, Р, В₁, В₆, В₁₂, викасола.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 10 мл, цилиндрические маленькие пробирки 10 шт, стеклянные палочки, штатив для пробирок, пробиркодержатель, спиртовка, спички, воронка, фильтровальная бумага, химический стакан, флюороскоп.

Реактивы:

1. H₂SO₄ (конц.), 23 % раствор хлороформа, 5 % раствор FeCl₃;

2. анилиновый реактив (15 частей анилина и 1 часть HCl (конц.)), 23 % раствор хлороформа;

3. раствор цистеина — 0.25 г/л, раствор NaOH -100 г/л, раствор викасола — 0.5 г/л;

4. HNO₃ (конц.), сахароза (порошок), 1% раствор FeCl₃;

5. 10% раствор NaOH, 10% раствор HCl, 5% раствор K₄[Fe(CN)₆]; 1% раствор FeCl₃, 0.01% раствор метиленового синего, 10% раствор Na₂CO₃, раствор Люголя (0.1% раствор иода в рас­творе йодистого калия);

6. 1% раствор FeCl₃, рутин, насыщенный раствор, H₂SO₄ (конц.), 0.5% раствор HCl, феллингова жидкость, 10% раствор NaOH;

7. диазореактив - 5 капель 1% раствора сульфаниловой кислоты + 5 капель 5% раствор NaNO₂, 10% раствор Na₂CO₃,

8. HCl (конц.), Zn (мет.);

9. 1% раствор FeCl₃;

10. H₂SO₄ (конц.), 30% раствор NaOH, 10% раствор тиомочевины,.