Ход работы

На пластинке мягким карандашом отмечают линию старта на расстоянии 1.5-2.0 см от нижнего края. На этой линии через равные промежутки отмечают 7 точек для нанесения растворов аминокис­лот. С помощью капилляров наносят по 1.5 мкл (3 касания) рабочих растворов каждой из шести аминокислот и смеси аминокислот (од­но касание — 0.5 мкл, что соответствует 2*10^-3 мкмоль каждой ами­нокислоты). Между касаниями пятно подсушивают. Нельзя царапать слой катионита капилляром! Таким образом, впервые шесть точек внесены последовательно арг, гис, лиз, фен, тир, лей, а в седьмую — смесь аминокислот.

В камеру для хроматографии наливают цитратный буфер с рН 5.28 на высоту 1 см и помешают пластинку с нанесенными образцами. Стартовая позиция смеси аминокислот должна быть выше уровня налитого буферного раствора. Для разделения аминокислот буфер должен подняться по пластинке ровным фронтом на высоту 15 см. Для этого требуется около 2 ч. Процесс разделения можно значи­тельно ускорить, предварительно пропитав пластинки разбавленным (в 10 раз) буфером и высушив их.

По окончании разделения пластинки вынимают из сосуда с бу­фером, нижние кромки следует промокнуть фильтровальной бумагой и пластинки высушить в вытяжном шкафу при комнатной температуре. Затем их устанавливают в наклон­ном положении в вытяжном шкафу и опрыскивают из пульверизатора нингидрином до равномерного пропитывания. Потом их снова высушивают и прогревают в термостате при 40-50 °С 20 мин. Выявляются фиолетовые пятна аминокислот (снизу вверх): арг, гис, лиз, фен, тир, лей. Необходимо сравнить положение пятен стандартных растворов аминокислот с положением их при хроматографировании смеси аминокислот. Хроматограмму зарисовать в тетради.

Работа 5. Очистка белков методом диализа.

Диализ — освобождение коллоидов от низкомолекулярных ор­ганических и минеральных примесей с помощью диффузии послед­них через мембраны. Белки в растворе благодаря значительной вели­чине молекул не диффундируют сквозь полупроницаемую мембрану.

Исследуемый материал: раствор яичного белка.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 50 мл, цилиндрические маленькие пробирки 4 шт, стеклянные палочки, штатив для пробирок, химический стакан, нитки, целлофан, спиртовки, пробиркодержатель, кристаллизатор.

Реактивы: 1) 10% раствор NaOH, 2) 1% раствор CuSO₄, 3) Феллингова жидкость, 4) 1% раствор яичного белка с примесью 1% раствора глюкозы, 5) дистиллированная вода.

Ход работы

Наливают 15-20 мл исследуемого раствора в целлофановый ме­шочек и погружают его в стакан с дистиллированной водой таким образом, чтобы открытый край мешочка выступал над поверхностью воды. Через 1 ч с водой из стакана и раствором белка, содержащим примесь углеводов, проделывают биуретовую реакцию (на белок) и реакцию Феллинга (на глюкозу), чтобы убедиться в отсутствии белка и наличии глюкозы в воде из стакана.

Биуретовая реакция. К 5 каплям исследуемого раствора приба­вить 3 капли 10% раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1% раствора сульфата меди (II), перемешать. Содержимое пробирки приобретает си­не-фиолетовый цвет, что указывает на присутствие белка в растворе.

Реакция Феллинга. К 5 каплям исследуемого раствора прибавить 5 капель феллинговой жидкости и нагреть. Наблюдается образование оксида меди (I) красного цвета (Cu₂O), что указывает на присутствие глюкозы в растворе.

Работа 6. Методы количественного определения белка на примера биуретовой реакции.

Для количественного определения белков применяют физи­ческие, химические и биологические методы.

Наибольшее распространение из физических методов количе­ственного определения белков получили три: рефрактометриче­ский (по показателю преломления белковых растворов), спектрофотометрический (по поглощению в ультрафиолетовой обла­сти спектра) и полярографический (по кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок). Пикнометрический метод (по плот­ности белковых растворов) употребляется редко.

Химические методы количественного определения белков разнообразны. Наиболее простым химическим методом опреде­ления белка является количественное определение общего или белкового (после осаждения белка и отделения его от раство­римых азотсодержащих веществ) азота. Умножая величину процентного содержания общего азота на коэффициент 6.25 (среднее содержание азота в белках—16%, отсюда 100:16 = 6.25), получают данные о содержании сырого протеина. Про­делывая ту же операцию с величиной, характеризующей содер­жание белкового азота, получают данные о количестве белка. Эти способы условны, так как дают приблизительную оценку о количестве белка.

Биологические методы количественного определения белков применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Измеряя степень биологической ак­тивности препарата, можно составить представление о содержа­нии в нем белка, обладающего данной активностью. Этот метод тоже не дает абсолютных результатов.

Самым распространенным химическим методом количествен­ного определения белков является колориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности окраски цветных реакций, раз­вивающихся при взаимодействии белков с тем или иным специ­фическим реагентом. Чтобы рассчитать концент­рацию белка, в этом случае строят калибровочный график.

Биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодейст­вии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Интен­сивность окраски пропорциональна концентрации белка в растворе.

Материал для исследования: растворы яичного белка концентрации 5, 10 и 15 мг/мл, и раствор белка неизвестной концентра­ции.

Оборудование: штативы с пробирками; бюретки для биуретового реактива; склянки с растворами белка; пи­петки на 1 мл; ФЭК с кюветами с толщиной слоя 1 см, миллиметровка.

Реактивы: биуретовый реактив.