Практическая часть Определение активности лдг (общая)

Принцип метода Лактатдегидрогеназа катализирует превращение лактата в пируват при одновременном восстановлении НАД в НАД(Н), который далее восстанавливает в присутствии N-метилфеназонийметилсульфата йоднитротетразолиевый фиолетовый в красный формазан.

Основные показания к назначению анализа:

1. ретроспективная диагностика инфаркта миокарда;

2. определение степени активности заболевания при криптогенном фиброзном альвеолите и наружном аллергическом альвеолите;

3. маркер гемолиза in vivo (гемолитическая анемия) или в in vitro (артефакт);

4. мониторинг цитостатической химиотерапии различных опухолей.

Пределы активности:

ЛДГ при температуре 37 °С — 0,66 —2,66 мккат/л;

Доля фермента, устойчивая к действию мочевины (%), — 60—80.

Необходимые реактивы

1. Молочная кислота 80%-ная.

2. Натрия гидроокись, растворы 2 моль/л; 0,4 моль/л.

3. 0,45 моль/л раствор лактата натрия. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 5 мл 80%-ной молочной кислоты, добавляют 2 моль/л раствора едкого натра до получения рН 7,5 и доводят объем водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике.

4. Натрия фосфат пиро (Na4P2O7 ∙ 10 Н2О).

5. НСl 1 моль/л.

6. Натрия пирофосфат 0,03 моль/л, рН 8,8: 6,69 г натрия пирофосфата растворяют в небольшом количестве воды, добавляют 1 моль/л раствор НСl до получения рН 8,8 и доводят объем водой до 500 мл. Стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.

7. НАД-окисленная форма. Готовят из расчета 3 мг НАД на 1 мл воды. Раствор стабилен в течение 4 недель при хранении в холодильнике.

8. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина: 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в небольшом количестве 1 моль/л раствора НСl при нагревании на водяной бане. После охлаждения доводят объем 1 моль/л раствором НСl до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен в течение 1 года.

9. Пируват натрия (для построения калибровочной кривой): 11 мг кристаллического пирувата натрия растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой объем раствора до, метки; 1 мл раствора содержит 88 мкг пировиноградной кислоты. Рабочий раствор готовят разведением основного раствора в 10 раз бидистиллированной водой; 1 мл рабочего раствора содержит 8,8 мкг пировиноградной кислоты.

Ход определения

Опытная проба: 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД, термостатируют 5 мин при температуре 37 °С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл 0,45 моль/л раствора лактата натрия, предварительно инкубированных при температуре 37 °С, и инкубируют смесь при температуре 37 °С в течение 15 мин. Тотчас после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора едкого натра, перемешивают и через 10 мин измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

Холостую пробу ставят, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет активности производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора пирувата натрия готовят ряд разведений.

Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и измеряют, как опытные.

Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо калибровочного раствора добавляют воду.

Линейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/(с•л).

Норма лактатдегидрогеназы (ЛДГ общ) крови

Нормы ЛДГ крови
взрослые	0,8-4 мкмоль/ч*л	140-350 Ед/л
новорожденные	2,0-8 мкмоль/ч*л	400-700 Ед/л