2 Содержание лабораторного занятия

Цель занятия: ознакомление с технологией выделения внутриклеточных компонентов клеток микроорганизмов;

- овладение лабораторными навыками дезинтеграции микроорганизмов физическими (механическими) и химическими способами напримере разрушения клеток бактерий, дрожжей и грибов.

В фарфоровую ступку помещают 3 г биомассы, взвешенной с точностью 0.01 г, добавляют 6 г кварцевого песка и растирают в течение 10 мин.

В полученную гомогенную смесь добавляют 10 см³ 1/15 М расвора фосфатного буфера (рН-7,0), перемешивают и переносят в центрифужные пробирки. Смывают стенки ступки и пестик 10 см³ фосфатного буфера и сливают раствор в те же пробирки.

Центрифугирование проводят в течение 15 мин при 1200 g для дрожжевой и грибной биомассы и 30 мин при 6000 g - для бактериальной.

Супернатант переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³. Осадок объединяют, добавляют к нему 15 см³ фосфатного буфера и центрифугируют при тех же условиях.

Затем жидкость из центрифужной пробирки сливают в колбу с супернатантом. Доводят содержимое мерной колбы до метки фосфатным буфером и, после перемешивания, определяют содержание белка в растворе.

2.2.2 Разрушение биомассы в жидкой фазе

Для разрушения биомассы в жидкой фазе используют лабораторный гомогенизатор MPW-302. В металлическом стакане прибора объемом 200 см³ взвешивают 3 г биомассы с точностью 0.01 г, добавляют с помощью пипетки 6 см³ 1/15 М фосфатного буферного раствора. Стакан закрепляют в кольце прибора и погружают его в водяную баню со льдом. Разрушение проводят при скорости вращения насадки -5000 об/мин в течение 5 минут. Гомогенат освобождают от неразрушенных клеток и крупных клеточных частиц центрифугированием по выше изложенному режиму. Общий объем супернатанта доводят в мерной колбе фосфатным буфером до 50 см³.

2.3 Определение содержания растворимого белка в дезинтеграте

Для сравнения эффективности использованных методов дезинтеграции клеток микроорганизмов определяют количество растворимого белка в гидролизате и супернатанте по методу Лоури. Этот метод основан на измерении интенсивности окраски раствора, в котором осущетвляется по меньшей мере две цветные реакции на белок:

- биуретовая реакция на пептидные, т.е. -C0-NH- связи, с образованием окрашенного чаще всего в фиолетовый цвет комплексного соединения меди с анализируемыми пептидными группами (интенсивность окраски зависит от концентрации белка в растворе)

Материалы и оборудование

Весы лабораторные 4-го класса точности, с наибольшим преде­лом взвешивания 500 г ВЛКТ-500М; весы лабораторные 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г ВЛР-200; водяная баня EL-20; гомогенизатор MPW-302; колориметр фотоэлектрический концентрационный КФК-2; центрифуга лабораторная медицинская ОПн-8; воздушный холодильник с пробкой; колба коническая. Кн-2-100; колба мерная 2-1 (2)-50; пипетки 2-1 (2)-5(10); пробирки химические П2; пробирки для центрифугирования; фарфоровая ступка N 4, 5; цилиндр 2(3)-100; кварцевый песок; казеин; натрия гидроксид, 0,1 и 0,25 Н раствор; реактив А - 2% раствор карбоната натрия в 0,1 Н растворе гидроксида натрия; реактив В - 0,5% раствор сульфата меди (кристаллогидрат) в 1% растворе виннокислого натрия или калия; реактив С - готовят перед определением, смешивая 50 см³ реактива А с 1 см³ реактива В; реактив Фолина; фосфатный буфер (рН-7,0); дистиллированная вода; калибровочный график.

Ход работы

При выполнении данной работы студентам предоставляют образцы свежесобранной бактериальной, дрожжевой и грибной биомассы. В каждом варианте работы проводят разрушение одного из видов биомассы химическим и физическим способами, определяют количество выделившегося белка и оценивают эффективность примененных методов дезинтеграции.

2.1 Разрушение клеток химическим методом

В конической колбе объемом 100 см³ взвешивают 0,5 г биомассы с точностью 0.001 г, добавляют 40 см³ 0,25 Н раствора гидроксида натрия. Закрывают колбу пробкой с воздушным холодильником и помещают ее на водяную баню.

Гидролиз проводят при температуре 90°С в течение 1 часа. Затем колбу охлаждают под струей холодной воды и переносят ее содержимое в мерную колбу объемом 50 см³ .

С помощью дистиллированной воды доводят объем гидролизата до метки, перемешивают и используют для определения содержания в нем растворимого белка.

2.2 Разрушение биомассы физическим (механическим) методом

2.2.1 Разрушение биомассы в твердой фазе

В фарфоровую ступку помещают 3 г биомассы, взвешенной с точностью 0.01 г, добавляют 6 г кварцевого песка и растирают в течение 10 мин.

В полученную гомогенную смесь добавляют 10 см³ 1/15 М раствора фосфатного буфера (рН-7,0), перемешивают и переносят в центрифужные пробирки. Смывают стенки ступки и пестик 10 см³ фосфатного буфера и сливают раствор в те же пробирки.

Центрифугирование проводят в течение 15 мин при 1200 g для дрожжевой и грибной биомассы и 30 мин при 6000 g - для бактериальной.

Супернатант переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³. Осадок объединяют, добавляют к нему 15 см³ фосфатного буфера и центрифугируют при тех же условиях.

Затем жидкость из центрифужной пробирки сливают в колбу с супернатантом. Доводят содержимое мерной колбы до метки фосфатным буфером и, после перемешивания, определяют содержание белка в растворе.