5.1.7. Способи пересадки ембріонів реципієнтам
Однією з основних умов високого рівня приживлення ембріонів є синхронізація охоти у донора і реципієнтів. Різниця в часі не повинна перевищувати ±24 години, оптимальні результати одержують за різниці не більше 12 годин. Особливо слід зазначити, що синхронізація ембріон-реципієнт має важливіше значення для успішної трансплантації, ніж синхронізація донор-реципієнт. Нині пересадку ембріонів реципієнтам здійснюють хірургічним і нехірургічним методами.
Хірургічний метод. Застосують два способи. Перший спосіб −лапаротомія по білій лінії черева з використанням загального наркозу в положенні тварини лежачи на спині на особливому похилому операційному столі. Цей метод можна використовувати тільки для телиць. Здійснюють так як і при вимиванні ембріонів.
Другий спосіб пересадки − менш трудомісткий, здійснюється в положенні стоячи шляхом розрізу черевної стінки у області голодної ямки, із застосуванням місцевої анестезії (5 мл 2-процентного розчину новокаїну і 0,6 мл комбелену); по лінії розрізу пошарово −140 мл 2-процентного розчину новокаїну. Роги матки підтягують, як і при вимиванні ембріонів, стінку рогу матки проколюють тупою голкою, в цей отвір вводять скляну піпетку із зародком, при цьому кінець піпетки спрямовують у бік верхівки рогу матки якомога ближче до місця його з'єднання з яйцепроводом (рис. 53).
Після пересадки на розріз накладають три шари швів − на очеревину і прямий внутрішній м'яз, на косий зовнішній м'яз і підшкірну клітковину − кетгутом і на шкіру − лавсановою ниткою або шовком. Через 14 днів зовнішні шкірні шви знімають. При операціях по білій лінії черева використовують тільки кетгут, щоб уникнути повторної фіксації тварини. Ефективність хірургічного методу ТЕ великої рогатої худоби становить 60...70%. Слід зазначити, що хірургічний метод потребує великих витрат засобів, його застосування стримується складністю проведення операції у виробничих умовах через отримання травм унаслідок реакції м'язів і неможливість багаторазового використання реципієнтів. Останнім часом ТЕ ембріонів великої рогатої худоби здійснюється нехірургічним способом, перевага якого полягає не тільки у відносній простоті і більшій економічності, а і в можливості багаторазового використання реципієнтів
(за Л.К. Ернстом ІН.І. Сергєєвим, 1989)
Нехірургічний метод. Спочатку реципієнтів піддають ректальному обстеженню − тільки тварини, які мають добре розвинене жовте тіло допускаються до використання. Телиць-реципієнтів фіксують, зовнішні статеві органи обмивають теплою водою з милом, дезінфікують, роблять сакральну анестезію 2-процентним розчином новокаїну (5 мл). Пайєту заповнюють розчином Дюльбекко з антибіотиками і 10...20% фетальної сироватки теляти, який містить ембріони. Розчин із ембріонами відділяють двома міхурами повітря від додаткової кількості розчину біля пижа пайєти і вільного кінця пайєти. Пайєту поміщають у наконечник катетера для ТЕ типу Касу (рис. 54, 55). Катетер розміщують у захисний чохол і за температури +37°С доставляють до місцяпересадки. Підготовлений до пересадки катетер вводять у піхву до шийки матки, проривають захисний чохол і під ректальним контролем проводять катетер через шийку матки в ріг на відстань не менше 5...7 см від тіла матки. Ембріони потрібно пересаджувати якнайдалі в ріг матки, але при цьому не пошкодити слизової оболонки рогу і шийки матки, якщо на катетері після витягування буде кров, ембріон швидше за все не приживеться.
Рис. 54. Катетер для нехірургічної пересадки ембріонів:
А - катетер у зібраному вигляді; Б - санітарний чохол; В - трубка з неіржавіючої сталі; Г - уретральний катетер із шприцом для виштовхування ембріону; 1 - санітарний чохол, 2 - трубка; З - розширений отвір; 4 - дистальний кінець трубки; 5 - катетер; 6 - отвір катетера; 7, 8, 9 − розташування середовища і робочої частини катетера; 10 - перехідник сполучення із шприцом; 11 - пластиковий шприц (за Л.К. Ернстом і Н.І. Сергєєвим, 1989)
Рис. 55. Металевий катетер для нехірургічної пересадки ембріонів великої рогатої худоби:
1 - металева трубка; 2, 4 - наконечник катетера, що знімається; З - отвір наконечника; 5 - стилет; 6 - пайєта у наконечнику; 7 - пробка пайєти; 8 - середовище; 9 - повітря; 10 - середовище із ембріоном (за Л.І.Ернстом і Н.І.Сергєєвим, 1989)
Переконавшись у правильності розташування катетера (щоб вихідний отвір у ньому не притискався до стінки рогу), необхідно натиснути на шток катетера, видавлюючи вміст пайєти разом із ембріоном у просвіт рогу матки. Катетер плавно виймають. Як правило, ембріон пересаджують у ріг матки зі сторони яєчника із жовтим тілом, при білатеральній пересадці аналогічним чином вводять інший катетер (рис. 56). Катетер можна використовувати повторно після його промивання і дезинфекції. Пересадка двох ембріонів збільшує частоту тільності.
Рис. 56. Схема розташування катетера в розі матки за нехірургічної пересадки
(за Л.І.Ернстом і Н.І.Сергєєвим, 1989)
Контроль приходу реципієнтів у охоту після пересадки. На60...90 день тварин досліджують на наявність тільності ректальною пальпацією або методом визначення рівня прогестерону в крові чи молоці через 14... 18 діб після пересадки (менш поширений метод). У тільних реципієнтів контролюють випадки і частоту абортів. Остаточні показники пересадки враховують за наслідками отелення.
Вплив безпосередньої пересадки кріоконсервованих ембріонів на тільність телиць-реципієнтів. Слід зазначити, що під час трансплантації кріоконсервованих ембріонів також здійснюють оцінку їх якості за морфологічними показниками. Однак, останнім часом використовують метод прямої пересадки заморожено-розморожених ембріонів великої рогатої худоби, коли трансплантацію зародків реципієнтам здійснюють відразу після розморожування без вилучення із пайєти і відмивання від кріопротектора. У цьому разі як кріопротектор найчастіше використовують 1,5 М розчин етиленгліколю. Недоліком методу прямої пересадки є ризик використання для трансплантації недостатньо оцінених ембріонів, але перевагою є зменшення кількості операцій.
Використовуючи метод прямої пересадки ембріонів великої рогатої худоби голштинської породи німецької селекції було проведено дослідження з вивчення рівня приживлення залежно від стадії розвитку (пізні морули, ранні бластоцисти). Через відсутність морфологічної оцінки зародків після розморожування, за використанням цього способу пересадки, важливим є вивчення впливу стадії розвитку ембріонів з метою підвищення успішної тільності реципієнтів.
Було використано телиць-реципієнтів із синхронізованим статевим циклом, яким проведена нехірургічна трансплантація на 7-й день від виявленої охоти. Аналіз експериментальних даних свідчить, що метод прямої пересадки є досить ефективним під час одержання телят-трансплантантів і дозволяє отримати тільних реципієнтів на рівні 56% (14 із 25). Рівень тільності відповідає вітчизняним і світовим показникам під час пересадки кріоконсервованих ембріонів великої рогатої худоби.
Враховуючи високу вартість імпортованих ембріонів, слід віддавати перевагу одержанню вищого відсотка приживлення їх після нехірургічної трансплантації. Під час перевірки рівня тільності кріоконсервованих зародків, які перебували в замороженому стані від одного місяця до одного року, встановлено, що на приживлення ембріонів після нехірургічної пересадки не впливає тривалість їх зберігання у скрапленому азоті. Так, тільність після пересадки ембріонів, що зберігалися у скрапленому азоті один місяць, була 36,4%, а після розморожування зародків через 7... 12 місяців − 72,7%, приживлення ембріонів після чотирьох років зберігання становило 61,5% і 50,0% − після десяті років. Таким чином, збільшення часу перебування ембріонів у скрапленому азоті не виявляє суттєвого впливу на наступну життєздатність зародків. Здебільшого цей показник залежить від якості ембріонів перед заморожуванням.
Аналіз результатів літературних даних та власних досліджень свідчить, що розроблені сучасні методичні підходи до заморожування ембріонів забезпечують їх збереженість досить тривалий час і відновлення життєздатності після розморожування на достатньо високому рівні. Враховуючи, що часто під час трансплантації свіжо одержаних ембріонів відсоток тільності реципієнтів є на рівні 40,4%, кріоконсервованих − не перебільшує 45%, одержаний нами відсоток тільності реципієнтів (61,5% і 50,0%) після прямої пересадки кріоконсервованих ембріонів з чітким відбором телиць та синхронізацією їх статевих циклів, перевагу у використанні має саме цей спосіб трансплантації зародків.
Дослідженнями впливу стадії розвитку ембріонів на ефективність їх приживлення після трансплантації реципієнтам установлено, що після трансплантації ранніх бластоцист тільність і народження телят були на рівні 72,7% (8 із 11), а пересаджені пізні морули імплантувалися на рівні 35,7% (5 із 14).
Отже, для підвищення ефективності нехірургічної трансплантації ембріонів великої рогатої худоби слід використовувати зародки, заморожені для прямої пересадки, з урахуванням стадії розвитку ембріони і здійсненням відповідної підготовки реципієнтів, це дасть можливість підвищити рівень імплантації та народження телят-трансплантанів до 70%. Використання детального аналізу стадій розвитку ембріонів великої рогатої худоби, що заморожуються в рідкому азоті і призначені для імпорту або збереження генофонду, дозволить достовірно прогнозувати їх приживлення після нехірургічної трансплантації.
Це особливо важливо у зв'язку з високою вартістю ембріонів, що володіють цінним генетичним потенціалом. Безсумнівно, плануючи завезення кріоконсервованих ембріонів імпортної селекції, доцільно враховувати рекомендації ембріолога з відбору кожного зародка після визначення селекційного походження ембріонів.
Тільки на основі детального вивчення основ ембріологічної генетики, генетики розвитку, якими повинен володіти біотехнолог, буде забезпечено високий рівень отримання телят-трансплантанів.