5.4.2. Методи визначення каріотипу і відбору ембріонів за статтю

З розвитком методів трансплантації і клонування ембріонів усе більшого значення набуває попередній відбір ембріонів за статтю і особливостям каріотипу. Впровадження методу визначення статі ембріонів перед їх трансплантацією дозволить цілеспрямовано одержувати бугаїв-трансплантантів для племпідприємств, успішно вирішувати ряд інших практичних питань у тваринництві. Наприклад, для розширеного відтворення стада у товарних господарствах, що спеціалізуються на виробництві молока, бажано одержувати теличок, а в товарних господарствах, що спеціалізуються на виробництві яловичини, − бугайців. Упровадження методів ідентифікації статі в доімплантаційних ембріонів дозволить уникнути одержання безплідних теличок-фримартинів за трансплантації реципієнтові двох ембріонів.

З цією метою використовують методи визначення каріотипу зародка (наявність X- і Y-хромосом) або імуногенетичне визначення наявності спеціальних Н-Y-антигенів, що містяться в зародках чоловічої статі.

У наш час стать ембріонів великої рогатої худоби, які є на стадії доімплантаційного розвитку, визначають за допомогою цитогенетичного та імунологічного методів.

Цитогенетичний метод визначення статі пізніх (9...14-денних) і ранніх ембріонів великої рогатої худоби заснований на ідентифікації чоловічих і жіночих метафазних статевих хромосом після культивування ембріонів у середовищі з митостатиком.

Методи оцінки пізніх ембріонів, однак, не знайшли значного розповсюдження через суттєве зниження їх приживаності порівняно з ембріонами більш ранніх стадій розвитку (6,5...8-денні). Цитогенетичний метод оцінки ранніх ембріонів, на відміну від інших методів аналізу, дозволяє не тільки визначити їх стать, а й ідентифікувати ряд хромосомних порушень, що, як відомо, є однієї з причин загибелі ембріонів, і, таким чином, вирішити питання про доцільність пересадження частини ембріона, що залишилася. Можливість установлення хромосомних аберацій дозволяє застосовувати метод при з'ясуванні причин аномального розвитку зародків, вивченні впливу на якість ембріонів препаратів, що використовуються для індукції суперовуляції, та в інших дослідженнях. Так, дослідження В. Юнга та інших учених, які проведені на 7-денних ембріонах великої рогатої худоби, показали, що морфологічно неякісні ембріони часто мали різні хромосомні порушення, такі як анеуплоїдія, тетраплоїдія і найбільш часто трапляється міксоплоїдія, що в першу чергу було пов'язано з препаратами, за допомогою яких викликалася суперовуляція. Спосіб викликання суперовуляції в корів за допомогою ФСГ кращий ніж обробка тварин ГСЖК − найбільша кількість ембріонів з геномними аномаліями була знайдена у тварин, яким ін'єктували ГСЖК.

Разом із тим, низька мітотична активність пізніх морул і ранніх бластоцист, порівняно з ембріонами більш пізніх стадій розвитку, ускладнює їх каріологічний аналіз, тому використання для аналізу 8... 10 клітин ембріона часто не дозволяє ідентифікувати стать. Можливість використання цього методу аналізу стосовно пізніх морул і ранніх бластоцист розширилася з удосконалюванням способів розподілу ембріонів на половинки і трансплантації половинок реципієнтам, що дозволяє одержати результати, які можна порівнювати з результатами пересадження цілих ембріонів. У цьому випадку одну половинку можна використовувати для аналізу, а іншу (кращу) кріоконсервувати або короткочасно зберігати в поживному середовищі за високої (+38,0°С) або зниженої (+5,0°С) температури. Після завершення хромосомного аналізу половинку, що залишилася, можна трансплантувати реципієнту і одержати нащадків з відомою статтю.

Однак, використання однієї половинки для аналізу і вилучення її з програми відтворення обмежує застосування цього методу в селекційній роботі. Проте, значимість такого способу оцінки ембріонів значно зростає з удосконалюванням методу одержання препаратів хромосом і розробкою способів множинного клонування ембріонів.

Дослідженнями доведено можливість одержання метафазних хромосом, що дозволяють визначити стать і хромосомні порушення в ембріонів великої рогатої худоби, отриманих іп vitro. Показано, що додавання гепарину в середовище культивування отриманих іп vitroбластоцист великої рогатої худоби сприяє значному підвищенню мітотичного індексу, що дає змогу збільшити кількість ембріонів з ідентифікованою статтю. Інкубація бластоцист великої рогатої худоби, отриманих іп vitro, у середовищі із солкоцерилом дозволяє подовжити Х-хромосому, що сприяє визначенню статі ембріонів.

Молекулярно-цитогенетична діагностика є сучасним напрямом у цитогенетиці, мета якої − розробка і вживання нових високоефективних методів аналізу хромосом. Поява молекулярно-цитогенетичних методів відкрила у вивченні хромосом людини і тварин новий вимір − субмікроскопічний рівень. Метод FISH-аналізу (Fluorescenceinsituhybrization) дозволяє об'єктивно виявляти індивідуальні хромосоми і їхні окремі ділянки на метафазних пластинках на основі особливостей їхньої молекулярно-генетичної будови. Об'єктом дослідження в даному разі є особливості нуклеотидного складу конкретної хромосоми або її окремої ділянки.

Класичний метод .РКН-аналізу заснований на гібридизації відомої за нуклеотидним складом ДНК-проби з ділянкою тестованої хромосоми і з подальшим виявленням результату гібридизації за міткою − флуоресцентним сигналом в очікуваному місці. Метод FISH-аналізу перетворився на необхідну аналітичну процедуру в ході цитогенетичного дослідження і став потрібним сьогодні в пре- і постнатальній діагностиці, в моніторингу зигот після штучного запліднення, в процедурі генетичної діагностики (ПГД) передімплантації під час селекції ембріонів з нормальним каріотипом за статтю і так далі. Основні переваги FISH-аналізу:

• висока роздільна здатність (на препаратах можна виявляти ті хромосомні порушення, що не візуалізуються в звичайному світловому мікроскопі);

• точність діагностики (розмір проб може варіювати від 90... 100 тис. до декількох мільйонів пар нуклеотидів, так що як мішень можуть бути не лише окремі гени або хромосомні ділянки, а й ціла хромосома).

• РІ8Н-аналіз дозволяє виявити, наприклад, декілька аномальних клітин серед тисяч з нормальним генотипом.

Зазвичай на третю добу життя в лабораторних умовах від декількох ембріонів − 1... 10 мікроманіпулятором беруть один з 6...8 бластомерів. Негайно, протягом декількох годин, проводять FISH-діагностику хромосоми або діагностику ДНК однієї клітини за допомогою модифікацій ПЛР-методу. Дуже важливо зазначити, що біопсія ембріону проводиться на тому етапі розвитку, коли всі його клітини − бластомери − не диференційовані, тотипотентні і тому можливе безпечне заміщення видаленої клітини за подальшого дроблення клітин, що залишилися.

Імунологічні методи. Стать ембріонів може бути встановлена ідентифікацією НУ-антигену за допомогою антитіл до Н-Y. Виявлення зв'язування антитіл до Н-Y-антигену з чоловічими ембріонами здійснюється двома методами. Характерною рисою першого, більш простого методу, є культивування клітин ембріонів у середовищі з комплементом,» що приводить до лізису клітин ембріонів чоловічої статі. Більш практичним є другий метод, що не ушкоджує ембріони, сутність якого полягає в одержанні і використанні вторинних флуоресцентних антитіл до Н-Y-антигену. Ефективність цього методу стосовно ембріонів великої рогатої худоби становить 85...87% .

Перспективним підходом до ранньої діагностики статі ембріонів великої рогатої худоби є створення специфічного для ДНК У-хромосоми молекулярного зонда. Для його одержання виділену з лімфоцитів бугая ДНК розщеплюють за допомогою рестриктаз. На наступному етапі отримані фрагменти ДНК вводять до складу самореплікующих елементів − плазмід. Для цього очищені молекули плазмідної ДНК розрізають за допомогою тієї ж рестриктази і гібридизують із фрагментом ДНК бугая, що приводить до з'єднання комплементарних липких кінців ДНК бугая і плазміди. Гібридні молекули, що утворилися під дією ферменту лігази і складаються з хромосомної і плазмідної ДНК, вводять в оброблені спеціальним чином бактеріальні клітини з метою їх розмноження − клонування. Потім гібридні молекули ДНК виділяють з бактерій і розрізають знов за допомогою тієї ж рестриктази, виділяючи таким чином клоновані фрагменти хромосомної ДНК - основу зонда. З метою з'ясування наявності комплементарних послідовностей нуклеотидів, виділені з декількох клітин ембріонів великої рогатої худоби ДНК гібридизують з радіоактивно міченим клонованим ДНК-зондом, після чого методом радіоавтографії виявляють ділянки хромосом, що зв'язують зонд. Можливості використання цього методу розширилися після розробки способів мічення зондів флуоресцентними барвниками, наприклад, біотипом. Дослідження препаратів ембріональних клітин під мікроскопом дозволяє відрізнити чоловічі клітини, ядра яких набувають бурого або чорного забарвлення, від жіночих - ядра не фарбуються.

У даний час спосіб визначення статі доімплантаційних ембріонів при наявності або відсутності Y-хромосоми за допомогою специфічного для ДНК Y-хромосоми зонда є найточнішим. Йогоефективність для ембріонів великої рогатої худоби − 100%, однак цей метод потребує великих затрат часу. Аналіз відомої послідовності ДНК Y-хромосоми дозволяє виявити також деякі хромосомні порушення, наприклад, наявність у клітинах ембріона двох Y-хромосом.

Викликає інтерес визначення статі ембріонів великої рогатої худоби шляхом культивування іп vitro2...5 клітин компактизованих ембріонів. Цей метод заснований на тому, що за розміщення в спеціальне середовище клітини ембріонів чоловічої статі, на відміну від ембріонів жіночої статі, добре розмножуються, що дозволяє вже через 3 години після початку аналізу зробити висновок про стать ембріона. Ефективність цього методу − 90.. .95%.

Нещодавно було розроблено новий ефективний спосіб відбору ембріонів великої рогатої худоби за статтю перед їх трансплантацією із застосуванням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), що забезпечує ампліфікацію специфічних повторюваних послідовностей ДНК У-хромосоми (потім ДНК піддають електрофорезу в 2-процентному агарозному гелі, яких зафарбовують бромистим етидієм і досліджують під ультрафіолетовим світлом). ПЛР дозволяє за єдиним бластомером, взятим шляхом біопсії, встановити стать доімплантаційного ембріона з дуже високою точністю (95,4%) за відносно короткий час. Ця методика може бути застосована для досить великої кількості ембріонів; біопсія клітини за допомогою мікроманіпуляторів не впливає на здатність ембріонів до розвитку іп vitroі ступінь їх приживлюваності порівняно з контрольними

ембріонами.

Розглядаючи питання одержання генетичних клонів або регулювання статі, слід пам'ятати про можливі наслідки такої роботи. Знижується спадкова мінливість, що є основою прогресивної еволюції, втрачається індивідуальна пристосованість організму до умов середовища. Заданими А.К. Голубєва (1990), в процесі еволюції ускладнилася організація тварин і їх виживання все більшою мірою визначалося підвищенням індивідуальної мінливості, тому в природних умовах стало невигідно виробляти велику кількість копій одного організму. Це також підтверджується тим, що мономорфність окремих видів і популяцій за локусами груп крові, білків призводить до їх вимирання або втрати пристосованості. Нині екологи вважають, що спеціалізація − ворог пристосованості. Тому, використовуючи методи генної інженерії, треба пам'ятати про необхідність збереження генетичної рівноваги у популяції та її генотипного складу і враховувати, що в еволюції генетичних систем постійно відбувається рекомбінація, що призводить до двох протилежних ефектів. Вона зменшує безпосередню пристосованість популяції, порушуючи коадаптовані поєднання генів. Але, постійно генеруючи нові генотипи, рекомбінація створює свого роду мобілізаційний резерв мінливості й збільшує тим самим можливість адаптації в умовах зміни середовища. Це є протиріччям між сучасним та майбутнім, між вимогами максимізації безпосередньої пристосованості й збереження генетичної пластичності вже є рухомою силою еволюції генетичної системи.