2.4. Технологія рекомбінантних днк

Технологія рекомбінантних ДНК (її називають такожмолекулярним клонуванням або генною інженерією) − це сукупністьекспериментальних процедур, що дозволяє здійснювати перенесення генетичного матеріалу (ДНК) з одного організму до іншого. Ніякогоєдиного, універсального набору методик тут не існує, але найчастішеексперименти з рекомбінантною ДНК здійснюють за такою схемою:

−з організму − донора потрібних генів - екстрагують чужоріднуДНК, піддають її ферментативному гідролізу (розщеплюють,розрізають) із'єднують (лігують, скріплюють) з іншою ДНК(вектора для клонування) з утворенням нової, рекомбінантноїмолекули;

−цю конструкцію вводять у клітину-реципієнт, де відбувається її реплікація й передача нащадкам. Цей процес називається трансформацією;

−ідентифікують і відбирають клітини, що несуть рекомбінантну ДНК (трансформовані клітини);

−одержують специфічний білковий продукт, синтезований клітинами-реципієнтами, що є підтвердженням клонування шуканого гена.

Необхідність маніпулювання генами диктується конкретними завданнями фундаментальних і прикладних досліджень. Для розуміння молекулярних механізмів функціонування окремих генів і взаємозалежних генетичних систем велике значення має робота з ізольованими генами. Такі дослідження дозволяють визначити границі генів, виділити їх у чистому вигляді й ідентифікувати елементи структури, істотні для функціонування. Доказом функціональної значимості виділеної ділянки генома може бути тільки його нормальна експресія в модельній генетичній системі. Тому наступним етапом дослідження виділеного гена завжди є переміщення його в таку генетичну систему, де експресія гена легко виявляється. Результати експресії оцінюють або за появою білкового продукту, що кодується досліджуваним геном, або за зміною функцій біологічної системи внаслідок появи в ній нової ферментативної або іншої активності.

У цей час за допомогою методів генної інженерії отримано дані про структуру й функціонування генів різноманітних організмів, що дало можливість перейти на якісно новий рівень генетичних досліджень. Це, по-перше, можливість перенесення гена в нове для нього генетичне оточення з подальшою його експресією, що веде до зміни властивостей організму, у геном якого вводиться ген (наприклад, створення продуцентів біологічно активних речовин або трансгенних тварин), а також здійснення генотерапії спадкових і придбаних захворювань шляхом штучного заміщення мутаційних алелей. По-друге, стало реальним конструювання нових генів шляхом об'єднання invitroяк відомих, так і нових, штучно синтезованих послідовностей нуклеотидів. Цей підхід використовується в білковій інженерії для дослідження функціональної значимості окремих амінокислот і доменів у поліпептидних ланцюгах ферментів, а також для створення нових білків. По-третє, у сучасній біотехнології з'явилася можливість застосовувати ізольовані гени в складі генно-інженерних конструкцій для одержання продуктів харчування і біологічно активних речовин білкової природи.

Оскільки в експериментальних умовах неможливо працювати з однією копією гена, одержання необхідного числа ідентичних копій гена або його частин є першим і одним із основних завдань генної інженерії. Для його вирішення використовують метод молекулярного клонування. Сутність методу полягає в тому, що нуклеотидна послідовність, яку необхідно виділити або розмножити, ковалентно вбудовується в молекули нуклеїнової кислоти, які здатні до самореплікації, і називаються векторами. Далі така послідовність нуклеотидів у складі вектора вводиться в клітини про- або еукаріотичного організму, і ці гібридні клітини в селективних умовах, що забезпечують збереження вектора усередині клітин, вирощують на поживному середовищі. У результаті створюється клон клітин, теоретично утримуючих ідентичні векторні молекули з однією й тією ж вставкою чужорідної послідовності нуклеотидів. Оскільки об'єднання молекул послідовності нуклеотидів, що клонуються, і вектора є не чим іншим, як рекомбінацією invitro, такі гібридні молекули називають рекомбінантними молекулами. У наш час розроблено численні методи, що дозволяють виділяти певні послідовності нуклеотидів зі складної суміші фрагментів хромосомної ДНК, а також здійснювати обмін між точно визначеними фрагментами генів й інших послідовностей нуклеїнових кислот. У всіх цих реакціях, як правило, використовуються високоочищені препарати нуклеїнових кислот і ферментів нуклеїнового обміну.

Конструювання рекомбінантних молекул здійснюється за допомогою цілого арсеналу ферментів − обов'язкового й незамінного інструменту практично всіх етапів цього складного процесу.