6.2. Культивирование вирусов

Вирусы могут размножаться внутриклеточно, поэтому исследователи проводили поиск новых простых и доступных сред для их культивирования. В настоящее время разработаны 3 принципиально различающихся способа культивирования вирионов: в полостях куриного эмбриона, в организме чувствительных животных и в культуре клеток.

Культуры клеток. Физиологические потребности культур клеток включают заменимые и незаменимые аминокислоты, витамины, солевые растворы, глюкозу, буферную систему и пр. Для разных вирусов характерен тропизм к определенным тканям. Поэтому культуры клеток из разных тканей названы чувствительными или пермиссивными клетками. Ввиду этого необходимо пересевать исследуемый вирус сразу на несколько разных культур клеток.

Культуры клеток получают после диспергирования органов и тканей. Диспергированные клетки помещают на плоскую поверхность, где они растут в виде монослоя.

Культуры клеток готовят из смешанных диспергированных клеток - это первичные и вторичные культуры клеток. Недостаток - они обладают малой продолжительностью жизни. Первично-трипсинизированные культуры клеток готовят из первичных культур, обрабатывая их ферментом трипсином. Такие культуры клеток также имеют недостатки - после нескольких пересевов они перестают размножаться. Диплойдные культуры клеток более пригодны для культивирования вирусов, но имеют срок жизни, примерно, до 30-40 пассажей. Гетерогаплойдные клетки - перевиваемые, способны культивироваться долгое время, но подвержены спонтанным трансформациям. Возможно использование опухолевых клеток, способных к многократному перевиванию.

После открытия Р. Дюльбекко (1952), широко распространился метод бляшек – колония негативная. Слоем агара покрывают монослой клеток, зараженных вирусом. Агар содержит индикатор нейтральный красный. После инкубации при 37^оС через 48 ч на агаре могут возникать неокрашенные пятна на розовом фоне, это результат цитопатического действия вирусов.

Куриные эмбрионы являются хорошей моделью для культивирования ряда вирусов (особенно, кори и гриппа). Вируссодержащий материал вводят в разные полости куриного эмбриона, в зависимости от вида вируса. В определенные сроки эмбрионы погибают за счет патогенного действия размножившегося вируса. На куриных эмбрионах вирус возможно идентифицировать с помощью методов иммунодиагностики или культуры клеток.

Применение животных, чувствительных к определенным вирусам, идеальный метод для культивирования вирусов. Животные погибают в определенные сроки, в зависимости от свойств (рода) вируса. Применение животных в настоящее время заметно снижается ввиду употребления культур клеток. Для установления инфекционной дозы пользуются индексом LD50 - это разведение вируса, поражающее 50 % животных или культур клеток.

6.3. Размножение вирусов

Для того чтобы вирусы могли размножаться, они должны внедриться в клетки-мишени хозяина. Одни вирусы имеют широкий спектр хозяев, другие имеют тропизм лишь к клеткам определенного типа. Вначале инфекции вирус вводит в клетку генетический материал (РНК или ДНК). Способность вирусов к размножению и судьба будущих клеток зависят от синтеза и функции вирусных генов и белков.

Для репликации вируса наличие собственных вирусных белков бывают недостаточным и в большей или меньшей степени они используют белки клетки-хозяина. Через несколько часов после заражения, в клетке обнаруживается лишь часть родительских вирусов. Эту фазу называют эклипсная. В это время геном вируса взаимодействует с хозяйским геномом или вирусным аппаратом для экспрессии. Затем следует несколько жизненноважных этапов и начинает накапливаться внутри клетки вирусное потомство. Это фаза созревания.

Жизненный цикл вирусов включает несколько обязательных этапов:

1. Адсорбция на клетке-мишени. Это первый необходимый этап, когда вирус через рецепторы (гликопротеины) распознает клетки-мишени по их рецепторам (например, для нервной ткани - N-ацетилнейраминовая кислота и др.). Происходит адсорбция вируса на клетках тканей или органов, этот процесс является пусковым механизмом в реализации дальнейших проявлений, иначе вирус проникнуть в клетку не может. Связывание требует определенной концентрации ионов в среде - для уменьшения процесса электростатического отталкивания. Когда проникновение вируса в клетку не происходит, то вирус отделяется от клетки и вновь адсорбируется на другой клетке-мишени с соответствующими рецепторами.

Оригинальной является адсорбция на клетке вируса гриппа. Белок НА - как главный вирусный антиген, имеет на N-конце сигнальный пептид из 16 гидрофобных аминокислот. Молекула НА заякоривается в мембране клетки карбоксильным концом НА2 (221 остаток), при этом гидрофильные остатки с 185-го по 211-ый пронизывают липидный бислой клетки, а последние 10 остатков выступают в цитоплазму.

Каждый мономер НА, содержащий сцепленные субъединицы НА1 и НА2, образуют структуру, состоящую из «стебля» (диаметр 0,08 мкм), на одном конце которого находится большая глобулярная структура диаметром 0,04 мкм, а у заякоренного в мембрану конца – глобула диаметром 0,01 мкм. В этой глобуле расположен N-конец НА1. В результате таких модификаций вирусная оболочка сливается с мембраной клетки и происходит снятие ее, а «голый» вирус проникает в клетку.

2. Проникновение вируса. Этот процесс является зависимым от энергии и происходит практически мгновенно после прикрепления вириона к рецепторам клетки в результате одного из трех явлений: перемещения всего вируса через мембрану, пиноцитоза вирусных частиц, слияния вирусной оболочки с цитоплазматической мембраной. Вирусы без оболочки проникают с помощью первых двух механизмов.

При слиянии вирусной оболочки с цитоплазматической мембраной клетки внутренние структуры вириона проникают в клетку (цитоплазму), а оболочка остается на поверхности клетки-хозяина.

Другой путь - проникновение вирусных частиц посредством рецепторного пиноцитоза (виропексии). При этом происходит образование вакуоли (эндосомы), которая сливается с лизосомой. Также сливаются липидные слои суперкапсида и мембраны лизосомы, благодаря чему нуклеокапсид проникает в цитоплазму, где и происходит его дальнейшее «раздевание».

Раздевание – это общепринятый термин для событий, когда вирусный геном получает возможность экспрессировать свои функции – наступает процесс депротеинизации генома. Клеточные ферменты дезагрегируют капсид до ДНК или ДНК-белки. При реовирусной инфекции в них удаляется только часть капсида, но геном экспрессирует свои функции. Для поксвирусов стадии делится на две: на первой стадии ферменты хозяина удаляют наружное покрытие, на второй - ДНК освобождается из сердцевины.

3. Синтез вирусных частиц. Транскрипция - важное событие из ранних циклов вируса с негативным РНК-геномом. На втором месте стоит другой процесс- репликация генома. До тех пор, когда концентрация новосинтезируемых белков, считанных с мРНК, не станет критической величиной, аппарат синтеза РНК будет работать на транскрипцию. Когда нуклеокапсидные белки свяжутся с мРНК, произойдет переключение синтеза на репликацию. Она приводит к сборке новых нуклеокапсидов.

В ходе размножения вируса в клетке необходимыми являются следующие этапы:

а) Организация вирусных геномов и их кодирующих функций,

б) Экспрессия вирусных генов,

в) Репликация вирусных геномов,

г) Сборка и созревание новых вирионов.

Общим положением является: клеточную транскриптазу для синтеза вирусной мРНК могут использовать только ДНК-содержащие вирусы, проникающие в ядро, другие вирусы вынуждены создавать собственные ферменты для синтеза мРНК.

Вирусы с одноцепочечной РНК по механизму размножения в клетке можно поделить на три группы: в первую входят РНК, геном которых выполняет две функции, например, как мРНК (позитивный геном).

Первая группа. Вирусы с одноцепочечной РНК (позитивный геном). Перенос генома в цитоплазму открывает путь для ранних биохимических процессов. Вирионные РНК должны раздеваться при низких значениях рН, когда нуклеокапсид сжимается в диаметре на 15 %, что и обеспечивает раздевание РНК. Освободившись от капсида, вирионная РНК далее функционирует как обычная мРНК. Наиболее вероятное место инициации трансляции кодон AUC, который расположен через 59 нуклеотидов от 5΄- концевого 7΄- метилгуанинового кэпа. Кэп или «шапочка» – это особый участок на 5^΄- конце мРНК, состоящий из метилированного гуанина и 10-13 прилежащих нуклеотидов. Он необходим для распознования мРНК рибосомой. Трансляция происходит непрерывно с образованием 4 неструктурных полипептидов. Стабильные полипептиды, кодируемые вирусом, катализируют репликацию и трансляцию, протекающую на мембране хозяйской клетки. На 3΄- полиаденилированном участке РНК начинается синтез новой вирионной РНК. Полимеризация при помощи РНК-зависимой РНК-полимеразы дает полноразмерную минус-нить РНК. Она служит матрицей для синтеза двух транскриптов. В результате инициации на 3`-конце минус-цепи РНК полимеризации, образуются новые полноразмерные плюс-РНК.

Вторая группа. Ее составляют РНК-содержащие вирусы одноцепочечные (негативный геном). Механизм транскрипции этой группы достаточно уникален. Транскрипция вириона с негативным РНК-геномом осуществляется вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой. Она использует кэпированный и метиллированный 5΄-конец клеточной мРНК, которая и синтезируется клеточным ферментом РНК-полимеразой 2. РНК-полимераза 2 выполняет роль затравки для синтеза РНК. Первая стадия - гидролиз вирусной эндонуклеазой донорной мРНК. Следующая стадия - это осуществление вирусной транскриптазой присоединения к «затравке» гуанилового остатка. Она спаривается с предпоследним цитидиловым остатком вирионной РНК. Последующая элонгация транскриптата осуществляется транскриптазой вируса. Репликацию осуществляют вирусспецифические белки. Они отсутствовали вначале транскрипции. Репликация ведет к сборке новых нуклеокапсидов, истощающих этот пул белков и тогда происходит переключение репликации на трансляцию. Продуктом репликации является создание комплементарной копии всех сегментов генома вируса. Эти копии служат матрицей для получения точных копий генома.

Третья группа. РНК-содержащие вирусы с монолитным геномом, имеют диплойдную структуру. На РНК-матрицах очищенный фермент синтезирует одноцепочечную ДНК или комплементарную кДНК - это минус-цепь. Синтез минус цепи проходит справа налево - относительно РНК. В синтезе плюс-цепи ДНК затравкой является вирусная РНК. Одна копия ДНК вируса интегрирована с ДНК клетки. Провирус реплицируется и только тогда передается дочерним клеткам. Свободные линейные провирусы ДНК – это предшественники интегрированных провирусов. Часть линейных свободных молекул вирусной ДНК может превращаться в ядрах в ковалентно замкнутые кольца, количество которых нарастает до 100 копий. Вирусная РНК связывается с интегрированным провирусом и транскрибируется РНК-полимеразой-2 хозяина. Первичным продуктом транскрипции провируса, является РНК полноразмерная. Около половины полноразмерной РНК упаковывается в вирионы.

Вирусы, содержащие двухцепочечную РНК. Геном реовируса транскрибируется внутри частично раздетого капсида вирионной полимеразой, через его открытую вершину выходят 10 мРНК-плюс транскриптазы 10-ти генов. Молекулы мРНК транслируются, обеспечивая синтез вирусных белков, и включаются по 1 молекуле мРНК каждого из 10 генов в состав частиц-предшественников. Каждая мРНК служит матрицей для синтеза комплементарной цепи, что ведет к образованию двухцепочечных сегментов генома.

Геномные ДНК- содержащие вирусы делятся на 4 группы.

1). Геномы папова-, адено- и герпесвирусов транскрибируются и реплицируется в ядре клетки-хозяина. После проникновения в клетку капсиды транспортируются к порам ядерной мембраны, затем под влиянием вирусных факторов вирусные ДНК выходят в нуклеоплазму и накапливаются в ядре клетки. При этом вирусы используют мРНК и ферменты клетки-хозяина. Первыми экспрессируются -белки, затем -белки и после -белки. мРНК образуется из -22 и -47. Транскрипция ДНК осуществляется РНК-полимеразой. ДНК реплицируется по механизму катящегося кольца. Из белка  -5 образуется капсид.

2). Вторую группу составляют поксвирусы. Начальные события происходят в среде цитоплазмы, где нуклеотиды высвобождаются и инициируют транскрипцию. Через четыре пять минут появляется мРНК. При раннем синтезе образуются 70 белков, ДНК-полимераза. На ранних стадиях ДНК-полимераза расщепляет двухцепочечную ДНК. Для ее репликации используются вирусные белки. Репликация начинается на двух концах генома, где вначале происходит расщепление и расплетение цепей на мелкие фрагменты ДНК. ДНК-полимераза заполняет промежутки по принципу репарации ДНК.

3). Третью группу составляют парвовирусы. Репликация ДНК проходит в ядре клетки-хозяина и зависит от клеточных функций. ДНК сворачивается в шпилечную структуру и она является затравкой. Первые 125 пар оснований проходят с родительской цепи на дочернюю и этот фрагмент служит матрицей. Расщепление цепи приводит к инверсии и появлению 2-х типов концевых последовательностей. ДНК образует одноцепочечное кольцо и далее может синтезироваться популяция ДНК-цепей, комплементарных одноцепочечной геномной ДНК. Для синтеза необходима клеточная ДНК-полимераза. Происходит транскрипция генома вируса.

4). Эту группу составляет вирус гепатита В. Кольцевые вирусные ДНК функционируют как матрицы для синтеза вирусной мРНК и плюс-цепи РНК, которая служит матрицей для синтеза минус-цепи ДНК. Плюс-цепь РНК, новосинтезированная вирусная ДНК-полимераза (обратная транскриптаза) и блок затравки для синтеза минус-цепи ДНК собираются вместе в комплекс с полипептидом сердцевины вируса и образуют нуклеокапсид вириона. Внутри нуклеокапсида синтезируется минус-цепь вирусной ДНК. На матрице минус-цепи ДНК в кольцевой конформации синтезируется плюс-цепь ДНК и частицы собираются в вирион.

Трансляция белков. Ранние вирусные мРНК вскоре после их синтеза транслируются на клеточных рибосомах. Количество ранних белков разных вирусов неоднозначно. Ранние белки - это вирусные полимеразы, матричные протеины, регулярные белки, структурные белки полипептидов. Ранние и поздние белки - это удобные термины, их нельзя понимать буквально. Многие ранние белки синтезируются и на более поздних стадиях (мРНК), и часть структурных белков- Iva2 и IX синтезируются в ранней стадии и т.д. Ранние белки - необходимая стадия данной реакции.

Регуляторные белки запускают репликацию вирусных геномов, вирусспецифические полимеразы участвуют в образовании молекул ДНК дочерних популяций, матричные белки служат для репликации нуклеиновой кислоты или регуляции относительного количества различных транскриптов.

Поздние вирусные белки синтезируются, примерно, через 17-20 ч после заражения клеток хозяина. Большинство вирусных белков представляют структурные белки вириона или их предшественники. Продолжают синтезироваться и некоторые ранние белки, например, ранний неструктурный ДНК-связывающий белок. Другие белки, которые участвуют в этапах сборки, синтезируются как поздние белки.

Сборка, созревание и выход вириона из клетки. Сборка и выход новых вирионов у разных вирусов происходит

по нескольким путям: это может быть путь отпочковывания (клетка остается жизнеспособной), или выход через аппарат Гольджи или выход с лизисом клетки.

Например, Тогавирусы (РНК-позитивный геном). По мере продвижения белков через аппарат Гольджи происходит модификация их, в том числе гликопротеинов. Наблюдается 25-мин лаг-фаза между окончанием синтеза гликопротеина и появлением его на мембране клетки-хозяина. При воссоединении трех структур (бислоя липидов, гликопротеновых полимеров и нуклеокапсида) образуется вирион.

Это происходит на мембране клетки-хозяина.

Нуклеокапсиды образуются в цитоплазме при связывании плюс-цепи 49s-РНК с капсидными полипептидами. Белок нуклеокапсида имеет на карбоксильном конце домен, который связывается с цитоплазматическим доменом. Это запускает процесс почкования. К этому времени гликопротеины собрались на поверхности клетки. Нуклеокапсиды узнают скопления гликопротеинов и связываются с ними. Это запускает механизм обволакивания мембраны вокруг сферических нуклеокапсидов. Достраивание мембраны, обволакивающей нуклеокапсид, приводит к освобождению вириона путем отпочковывания от клетки.