5.2. Посев и культивирование микроорганизмов

В лабораторных условиях для роста микроорганизмов используют питательные среды, разлитые в пробирки, чашки Петри, флаконы и пр. Посевы микробов проводят с помощью бактериальной петли, капельно, ватными тампонами и пр. Посевы проводят поверхностно (штрихи по поверхности сред) и глубинно (уколы в столбик). Посевы и культивирование осуществляют в соответствии с типом дыхания микроба (аэроб или анаэроб). Аэробные микробы высевают на поверхность питательных сред, а для культивирования анаэробных бактерий необходимо выполнить определенные условия - создать среду, не содержащую кислород, например, с помощью вазелина, который помещают поверх питательной среды, при посеве уколом в глубину агара или путем применения питательных сред, содержащих нативные белки или кусочки свежих органов. Возможно культивирование под часовыми стеклами, засевая вначале аэроб, а через 4 ч - анаэроб. Посев покрывают часовым стеклом, а края стекла засевают той же аэробной культурой или заливают парафином. Для роста анаэробных микробов разработаны специальные приборы, называемые анаэростаты, где откачивают воздух и замещают его азотом, с разрежением воздуха 1-8 мм или посевы содержат в вакуум-эксикаторах и пр.

Для промышленных целей проводят культивирование микроорганизмов в емкостях для стационарного выращивания, но выход бактериальной массы с питательных сред, которые сохраняются постоянно, очень низкий. Получаемые в этих емкостях культуры микробов называют периодическими, т.к. они проходят все фазы роста микроба в замкнутой системе (см. следующий раздел)

Метод использования проточного культивирования является наиболее благоприятным. Существует два типа аппаратуры: хемостаты и турбидостаты. Хемостаты - это аппараты, в которые постоянно добавляют свежую питательную среду. Благодаря перемешиванию и аэрации создаются оптимальные условия. По мере поступления новой среды, удаляют часть среды с микроорганизмами.

Работа турбидостата основана на поддержании постоянной плотности микробов в аппарате. Степень мутности контролируется фотоэлементами. Питательные вещества в них содержатся в избытке и контролируются автоматически. Обеспечивается максимальный рост и выход биомассы.

Таким образом, по способу культивирования различают культуры - периодические (стационарный способ без замены питательной среды) и непрерывные (хемостатные и турбидостатные). Культура, все клетки которой делятся одновременно - синхронная.

5.3. Морфология колоний и рост микробов в жидкой среде

Рост микробов на плотной питательной среде через несколько часов (18-24) или дней (Leptospira и пр.) сопровождается образованием определенных скоплений, состоящих из бактерий одного вида. Эти скопления образуются в результате размножения бактерий на питательной среде из одной или 2- 3 клеток одного генотипа. Эти видимые невооруженным глазом скопления моноклона микробных клеток, выросшие в результате культивирования на искусственных питательных средах, называют колонии.

Образовавшиеся колонии бывают разных размеров, в соответствии со свойствами вида бактерий: крупные- свыше 5 мм (Staphylococcus и др.), средние - 3- 5 мм (Arachnia и др.), мелкие- 1- 3 мм (Dermabacter и др.) и карликовые- меньше 1 мм (Mycoplasma и др.).

По виду (морфология колоний) они бывают круглые (Escherichia и др.), отросчатые (Сl. botulinum), дисковидные (Vibrio cholerae) и др. Края колоний гладкие (Listeria), фестончатые (Yersinia), морщинистые (Mycoplasma).

Поверхность также может быть гладкой (Shigella), морщинистой (Mycobacterium), в виде гривы льва (Bacillus), как шагреневая кожа - шероховатой (Corynebacterium). По цвету они могут быть: бесцветные (Shigella), красные (Escherichia) слаборозовые (Salmonella, серовар typhi), голубовато-дымчатые (Proteus), в виде капельки ртути (Bordetella), молочно-белые (Francisella), перламутровые (Listeria), мутные (Klebsiella), черные, синие, желтые или зеленые (Actinomyces). Колонии поднимаются над поверхностью среды (большинство бактерий), врастают в среду (Leptospira), врастают лишь центром (Mycoplasma). Могут быть плоскими и куполообразными, выпуклыми, вдавленными. По консистенции колонии бывают сухими (Pseudomonas), влажными (большинство), могут быть слизистыми (Salmonella cholerae suis серовар раratyphi B). Колонии могут иметь и другие признаки.

Колонии микроорганизмов могут быть окрашены в самые разные цвета. Обычно патогенные микробы не имеют окрашенных колоний. Окрашиваться колонии, и даже среды, могут за счет пигментов. Пигменты бывают водорастворимыми и водонерастворимыми. Например, пигменты хиноновые дают окрашивание желтого цвета, продуцируются видами стафилококка. Меланиновые пигменты дают черный и коричневый цвет, продуцируют их Бактеройды. Пирроловые пигменты окрашивают колонии в ярко красный цвет, выделяет их вид Serratio marcescens.

В жидких питательных средах микробы могут вызывать равномерное помутнение или пленку либо осадок. Пленка бывает поверхностной и пристеночной (Pseudomonas mallei), тонкая и нежная (Vibrio cholerae), сухая (Mycobacterium), рыхлая с отростками (Yersinia pestis) и пр. В жидкой питательной среде может образоваться помутнение (Shigella), просветление среды с образованием осадка (Bacillus), помутнение среды с образование осадка (Escherichia). Осадки в жидкой питательной среде бывают компактными (Clostridium botulinum), в виде комочка ваты (Bacillus), зернистыми (Corynebacterium), войлокообразными (Mycetes) и пр. Возможны комбинации этих признаков.

Рост бактерий. Рост - это упорядоченное увеличение всех составных клетки. Возможное увеличение размеров клетки за счет поглощения воды или отложения липидов не является ростом. Размножение – это достаточно сложный процесс, конечным этапом которого является увеличение числа клеток, составляющих культуру или популяцию.

Имеется четкая зависимость между сроками репликации ДНК и делением клетки. У E. coli при 37^о С деление происходит через 20 мин после завершения репликации хромосомы. Как правило, бактерии размножаются путем бинарного деления. После удлинения клетки в ней образуется поперечная клеточная мембрана, а в дальнейшем - новая клеточная стенка, в результате врастания внутрь клетки наружных слоев (в этом процессе принимают участие септальные мезосомы). Нуклеойд один, но может удваивается перед делением, равномерно распределяясь по дочерним клеткам. Завершение цикла репликации, ДНК включает синтез мембраны между точками прикрепления двух дочерних геномов, которые раздвигаются в стороны врастающей между ними поперечной мембраной. Клеточная оболочка удваивается и удлиняется. Далее наступает процесс расхождения двух дочерних клеток. В зависимости от скорости расхождения клеток образуются разные по морфологии бактерии.

Получение в процессе роста и деления отдельной клетки двух новых особей, способных к росту с той же скоростью, что и родительская клетка, приводит к увеличению числа новых клеток в культуре во времени в геометрической прогрессии, т.е. экспоненциально. Скорость роста микробной культуры часто выражают как показатель числа поколений в час. Для тех клеток, которые репродуцируются бинарным делением, генерацию определяют удвоением числа клеток. Например, если время генерации (удвоения) составляет 40 мин, то скорость роста культуры составляет 1,5 генерации в час (60 мин делится на 40 мин удвоения). Между скоростью роста и размером клетки существуют определенные математические уравнения.

Если в определенный объем питательной среды вносят клетки из культуры, выросшей до насыщения, и во времени подсчитывают число жизнеспособных клеток (с помощью их концентрации по данным фотоэлектрических приборов), то получают кривую, где имеют несколько фаз или стадий.

1 фаза. Лаг-фаза - это период, в течение которого клетки адаптируются к условиям среды, образуют ферменты, промежуточные вещества. Происходит синтез белка, рибосом. Но в этой фазе число живых клеток даже несколько уменьшается, адаптируясь к новой среде.

2 фаза. Предэкспоненциальная - в этой фазе большинство клеток увеличены в размере, микробы адоптировались к новым условиям, отмечен рост клеток, часть из них начала рост и размножение. Концентрация клеток увеличилась почти в два раза.

3 фаза. Экспоненциальная - клетки находятся в стабильном состоянии. Скорость синтеза нового клеточного материала постоянна, экспоненциально возрастает его масса и катализ, т.е. удваиваются. Клетки делятся с максимальной постоянной скоростью. Процесс продолжается до тех пор, пока не исчерпается основной запас питательных веществ и пока накопившиеся продукты метаболизма не будут тормозить рост клеток – тогда и наступает следующая фаза.

4 фаза. Постэкспоненциальная - концентрация клеток достигает 10⁷ на 1 мл, скорость роста клеток будет уменьшаться до тех пор, пока в среду не поступит новая порция среды и кислород (для аэробов).

5 фаза. Динамического равновесия - естественно наступающий период - недостаток питательных веществ и токсических продуктов приводит к увеличению отмирания клеток при определенном процессе замещения их новыми клетками. Число дочерних бактерий равно числу отмерших. При таком процессе количество жизнеспособных клеток остается достаточно постоянным, что приводит к временному динамическому равновесию между ростом, делением и отмиранием.

6 фаза. Ускоренной гибели - в условиях еще большего ухудшения питательных свойств и увеличения токсичности среды, после определенного равновесия, увеличиваться число погибших клеток и уменьшается количество жизнеспособных бактерий. Процесс ускоряется до тех пор, пока не достигнет постоянного уровня или постоянной скорости гибели клеток. На определенном этапе ускоренной гибели клеток, процесс начинает замедляться и постепенно переходит в новую фазу. При этом небольшое количество клеток в этой фазе продолжает расти и размножаться. Иначе процесс закончился бы на этом этапе.

7 фаза. Замедленной гибели - скорость отмирания клеток резко снижается, переходит в замедленную стадию гибели (после отмирания большого числа клеток). Небольшое число клеток продолжает расти и размножаться, но больших величин достичь не могут вследствие плохих условий выживания. Эта фаза переходит в последнюю стадию.

8 фаза. Балансирования - небольшое число клеток может продолжать размножение среди множества погибших клеток, балансируя между жизнью и гибелью в этих условиях. Эта фаза может оказаться относительно длительной, но она будет последней, если не будет добавлена новая порция питательных веществ.

Длительность каждой фазы роста бактерий в замкнутой системе определяется многими свойствами микроорганизмов, в том числе - скоростью деления, интенсивностью реакций обменных и пр.

Клетки, любой из этих фаз развития, перенесенные из этой среды в новую питательную среду - вновь повторят весь цикл развития популяции в замкнутой системе. Размножение микробов происходит разными путями, в зависимости от их природы. Можно различать: простое деление (большинство прокариотов), двустадийное развитие (хламидии и актиномицеты), сложное развития бактерий (миксобактерии и пр.), внутриклеточный процесс (вирусы и др.).