Глава 5. Питательные среды и культивирование микроорганизмов

Культивирование бактерий – это выращивание их на искусственно созданных питательных средах. Для этого в питательных средах создают все условия, необходимые для оптимального роста выращиваемых культур.

По пищевым потребностям, живые организмы делятся на: голозои - потребляющие твердые куски пищи, которые они и переваривают за счет гидролиза (человек, животные и пр.) и голофиты – утилизирующие питательные вещества в водных растворах как простые молекулы (микроорганизмы).

Установлено, что на жизнедеятельность микроорганизмов оказывают влияние многие факторы, например: ионная среда - большинство микроорганизмов лучше растет в зоне рН от 6,0 до 8,0. По отношению к температурным условиям среди микроорганизмов различают психрофилы (растут при низких температурных условиях - 15-20^о С), мезофилы - растут при 30-37^о С, термофилы- при 50-90^о С. Большинство прокариотов - мезофилы. Микробы называют галофилы, когда они живут при высоких концентрациях солей, нуждающиеся в высоком осмотическом давлении - осмофилы. Чем больше организм получает уже готовых соединений извне, тем ниже уровень его биосинтетических способностей.

5.1. Питательные среды

Для выделения чистой культуры бактерий, определения у ней биохимических, протеолитических и др. свойств, применяют специально приготовленные питательные среды, сбалансированные по необходимым питательным, ростовым и др. веществам, с фиксированным рН среды. По критерию пригодности, среды должны отвечать основным требованиям: иметь нужные для питания микроорганизмов вещества, в том числе ростовые, определенную рН и влажность, определенный окислительно-восстановительный потенциал, определенную прозрачность, должны быть стерильными, не содержать микроорганизмы.

Важным фактором является кислотность питательных сред, которая неоднозначна при культивировании разных микроорганизмов. Активная кислотность определяется наличием ионов Н⁺. В нейтральной среде, где количество ионов Н⁺ равно количеству ОН^- - рН равно 7,0. Большинство микроорганизмов развиваются при нейтральной или слабощелочной реакции среды. Грибы развиваются в более кислой среде. При подкислении среды до рН 4,0 развитие большинства бактерий прекращается. Чтобы избежать изменений рН добавляют в питательную среду буферную систему.

Питательная среда должна обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом (редокспотенциал - rh2), определяющим насышение среды кислородом. Так, насыщенный кислородом раствор обозначают rh2 = 41, а насыщенный водородом - rh2 = 0. Анаэробные микроорганизмы размножаются при rh2 не выше 12, а аэробные - при rh2 не ниже 14-20.

По консистенции среды бывают твердые (плотные), жидкие и полужидкие. Плотные среды готовят на основе агара, желатина, пептона, силикагеля. Агар - сложный полисахарид морских водорослей. Плавится при 100^о С, затвердевает при 45^о С. Плотные питательные среды содержат его в концентрации 1,5-3,0 %. Плотные питательные среды применяют для выделения чистой культуры бактерий, для получения изолированного роста микробов, для хранения и изучения их свойств и пр. Жидкие питательные среды готовят на экстрактах мясных продуктов, гидролизатах рыбных продуктов, биологических жидкостях (сыворотка, молоко, кровь и пр.). Жидкие питательные среды применяют для накопления биомассы микробов, обновления культур, выявления у них физико-химических свойств и пр. Полужидкие среды содержат 0,3-0,7% агара. Их применяют для определения свойств микроорганизма или роста прихотливых микробов. Сыпучие питательные среды применяют в промышленной микробиологии.

Питательные среды по составу бывают - белковыми, небелковыми и минеральными.

По происхождению питательные среды могут быть:

1. Естественными:

а) животными (кровь, сыворотка, желчь, кусочки органов),

б) растительными (кусочки овощей и фруктов).

2. Искусственными:

а) животными (мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный желатин и пр.),

б) рыбными (рыбные гидролизаты, рыбная мука и пр.),

в) растительными (отвары злаков, дрожжевые экстракты, картофель, рис, пивное сусло и пр.),

г) синтетическими (состоящими из известных веществ в определенных количествах),

д) полусинтетическими (это синтетические питательные среды, к которым добавлено определенной количество животных продуктов).

Питательные среды разделяют по назначению:

1. Консервирующие (для транспортировки материала после забора у постели больного).

2. Обогащения (для накопления определенных видов микроорганизмов).

3. Универсальные (простые среды для посева неприхотливых микроорганизмов).

4. Элективно-диагностические (бывшие селективные, элективные, специальные, между которыми нет особой разницы). Такие среды предназначены для первичного выделения микроорганизмов. Например, по отношению к лактозе, висмут сульфиту, тиогликоляту, солям и пр. При выделении бактерий кишечной группы иногда необходимо применение дополнительных элективно-диагностических сред (Ресселя, Олькеницкого, Клиглера).

5. Дифференциально-диагностические. Они предназначены для расшифровки вида выделенных бактерий. Например, среды Хиса и др.

Краткая характеристика питательных сред:

Консервирующие среды - глицериновая смесь с фосфатом натрия и хлоридом натрия, глицериновый консервант с хлоридом натрия и др. Применяют для транспорта посевного материала от места забора до бактериологической лаборатории, в условиях подавления роста посторонней микрофлоры.

Среды обогащения - эти среды применяют для накопления определенных видов или групп микроорганизмов, за счет создания им благоприятных условий и подавления роста других микробов - селенитовый бульон, среда Китта-Тароцци, тиогликолевая среда.

Универсальные - это простые среды, на которых хорошо растут неприхотливые виды микроорганизмов (патогенные и непатогенные). Например, мясопептонный агар (МПА), мясопептонный бульон (МПБ), и пр., некоторые из них являются основой для сложных питательных сред.

Элективно-диагностические (лат Еlectus - избираю) - специально приготовленные среды для первичного выделения определенных микробов, в условиях подавления роста других. Это ранее называемые селективные (лат Selectus - обогащаю), специальные и элективные среды, между которыми нет принципиальной разницы. Например, к таким первично-элективным средам относятся: кровяной агар для выделения стрептококков, молочно-желточно-солевой агар для выделения стафилококков, среда Мак-Коя-Чепина для туляремийного возбудителя, а также - гретый кровяной агар, среды Плоскирева, Эндо, Левина, Серова, Олькеницкого, Ресселя или Клиглера и др.

Дифференциально-диагностические - эти среды приготовлены для идентификации выделенной чистой культуры возбудителя до вида, групп, типов. Они сочетают свойства дифференциации и элективности. Их применяют для определения протеолитической или ферментативной либо редуцирующей и др. активности бактерий. Например, среды Хисса, молоко, желатин, среды для определения сероводорода, индола и пр.

Стерилизация питательных сред. Готовые среды подвергают стерилизации, выбирая режим и способ обработки в зависимости от состава и консистенции сред. Чаще всего, их стерилизуют в стерилизаторе (автоклаве). Продолжительность и быстрота нагревания в нем зависят от посуды, вязкости питательной среды и пр.

Питательную среду необходимо помещать в небольшие по объему емкости и ставить так, чтобы пар свободно циркулировал. Агаровые среды стерилизуют под давлением 1 атм (98 кПа) в течение 20 мин. Жидкие питательные среды можно фильтровать.

Питательные среды, готовые к употреблению, проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при 37⁰ С на 1 сутки, простерилизованные текучим паром - на 3-е суток. Сохраняют питательные среды в прохладном, темном и влажном месте.