Задание

При определении активности ЛДГ в сыворотке крови кинетическим методом получили следующие результаты: А₁ = 0,59, А₂ = 0,30

Рассчитать активность ЛДГ в МЕ/л, сравнить с нормой, КДЗ определения ЛДГ.

Ответить на вопросы:

1. Какие реакции лежат в основе метода?

2. Как называется тест, применяемый в данном методе?

3. По какой формуле рассчитывается фактор пересчета «Ф»?

4. Как рассчитать наклон кинетической кривой ΔЕ/мин?

Отделение «Лабораторная диагностика», 2 курс, 4 семестр. Тема: «Энзимодиагностика» Кинетический метод определения активности АЛТ в сыворотке крови.

Принцип метода. Оптимизированный кинетический энзиматический метод основан на следующих ферментативных реакциях:

1. а ланин + α-кетоглутарат ^АЛТ ПВК + глутамат

2. П ВК + НАДН+Н^{+ ЛДГ} лактат + НАД

Скорость окисления НАДН₂ в НАД пропорциональна активности АЛТ в пробе (непрямой оптический тест Варбурга).

Исследуемый материал. Свежая сыворотка или плазма крови без следов гемолиза.

Реактивы (компоненты набора реагентов «АлАТ-ВИТАЛ-06,16»):

№ 1 – буферно-субстратная смесь (буфер, рН 7,5, содержащий субстрат) - аланин 500 ммоль, трис/HCl – 100 ммоль/л.

№ 2 (лиофилизат) фермент-кофакторная смесЬ: α-кетоглутарат 15 ммоль/л, ЛДГ 1200 U/л , НАДН 0,18 ммоль/л.).

Приготовление рабочего реагента. Растворить содержимое флакона № 2 в 50 мл реагента № 1. Для получения оптимальных результатов выдержать рабочий реагент после полного растворения лиофилизата при комнатной температуре в течение 5-10 мин. Рабочий реагент стабилен в течение 48 ч при температуре хранения 2-4⁰С.

Условия проведения анализа.

Измерение проводят на СФ при λ=340 нм.

Длина оптического пути - 1 см.

Температура инкубации – 37⁰С (30⁰, 25⁰С).

Фотометрирование – против воздуха.

Перед проведением анализа следует нагреть рабочий реагент до выбранной температуры.

Ход определния: к рабочему реагенту добавляют исследуемый образец в соотношении 10:1 (например, 0,5 мл рабочего реагента + 0,05 мл образца). Перемешать, инкубировать при выбранной температуре 60 с. Затем считывать изменения абсорбции (экстинции) с интервалом 1 мин (или через другие равные промежутки времени) в течение 3 минут. Вычислить среднее изменение экстинции за 1 мин (ΔА/мин). Примечание. 1)Если (ΔА/мин) превышает 0,11/мин то необходимо развести образец в 10 раз в физиологическом растворе. Анализ повторить. Результат умножить на 10. 2) активность фермента в сыворотке снижается после 3 суток хранения при 2-4⁰С – на 10%, при 18-25⁰С – на 17%.

Расчет. Активность АЛТ (МЕ/л) = 1746 ·[ ΔА/мин ]

где 1746 – фактор (Ф), рассчитанный с учетом объема реакционной смеси и биологического материала, толщины кюветы, ммолярного коэффициента экстинции НАДН₂:

Ф =( V · 1000)/ (ε · L · v), где

V – объем реакционной смеси, мл.

1000 – коэффициент пересчета миллимоль в микромоль.

ε – миллимолярный показатель поглощения НАДН₂ в реакции = 6,22 л/(ммоль·см).

L – длина оптического пути = 1 см.

v – объем пробы (сыворотки крови или плазмы), мл.

Для пересчета МЕ/л в нмоль/(с·л) используют коэффициент 16,67.

Нормальные величины активности АЛТ в сыворотке крови:

Температура инкубации	370С	300С	250С
Женщины	До 31 МЕ/л	До 22 МЕ/л	До 17 МЕ/л
Мужчины	До 40 МЕ/л	До 29 МЕ/л	До 22 МЕ/л

Литература: «Методы клинических лабораторных исследований». Под ред В.С.Камышникова. М., МЕДпресс-информ, 2009.

Задача

При определении активности АЛТ энзиматическим кинетическим методом получили следующие результаты:

Экстинция опытной пробы при 340 нм	Время (мин)
0,51	2
0,49	3
0,44	4
0,40	5

Объем пробы = 20 мкл

Объем реагента = 200 мкл

Задание:

- Реакции, лежащие в основе метода.

- Название и принцип теста, здесь применяемого.

- Рассчитать фактор пересчета Ф.

- Рассчитать наклон кинетической кривой - ΔЕ/мин.

- Определить активность АЛТ в опыте в МЕ/л.

- Сделать заключение, сравнить с нормой, КДЗ АЛТ.

Занятие № 5. ПРОБЛЕМНЫЕ ЗАДАЧИ ПО ЭНЗИМОДИАГНОСТИКЕ

Задача 1. При определении активности АЛТ (37⁰С) энзиматическим кинетическим методом получили следующие результаты:

Е опыта	Время (с)
0, 51	60
0,44	120
0,38	180
0,34	240

V рабочего реагента = 0,5 мл; V cыворотки крови = 50 мкл.

Задание: 1) реакции, лежащие в основе метода; 2) название и принцип теста, здесь применяемого; 3) рассчитать фактор пе-ресчета Ф; 4)рассчитать наклон кинетической кривой - ΔЕ/мин; 5) определить активность АЛТ в сыворотке крови в МЕ/л; 6)сделать заключение, сравнить с нормой, КДЗ АЛТ.

Задача 2. При определении активности АЛТ (37⁰С) энзиматическим кинетическим методом получили следующие результаты:

Е опыта	Время (мин)
0, 51	1
0,49	1,5
0,47	2
0,45	4

V рабочего реагента = 0,4 мл

V cыворотки крови = 40 мкл

Задание: 1)Реакции, лежащие в основе метода; 2) наз-вание и принцип теста, здесь применяемого; 3) рас- считать фактор пересчета Ф; 4)рассчитать наклон кине-тической кривой - ΔЕ/мин; 5) определить активность АЛТ в сыворотке крови в МЕ/л; 6) Свнить с нормой для мужчин, сделать заключение, КДЗ АЛТ.

Задача 3. При определении активности АЛТ (37⁰С) энзиматическим кинетическим методом получили следующие результаты:

Е опыта	Время (мин)
0, 53	2
0,45	3
0,38	4
0,29	5

V рабочего реагента = 0,4 мл

V cыворотки крови = 40 мкл

Задание: 1)Реакции, лежащие в основе метода; 2) наз-вание и принцип теста, здесь применяемого; 3) рас-считать фактор пересчета Ф; 4) рассчитать наклон кинетической кривой - ΔЕ/мин; 5) Сделать расчет активности АЛТ в сыворотке крови в МЕ/л; 6) Сравнить с нормой. Сделать заключение. КДЗ АЛТ.

Задача. 4. Ознакомиться с инструкцией опредления активности α-амилазы кинетическим методом. Ответить на следующме вопросы:

1. Принцип метода. Почему этот метод относится к кинетическим?

2. Какие компоненты входят в состав реагента? Что является субстратом α-амилазы? Почему используется буфер с рН= 6,0? Для чего в состав реагента входит азид натрия? Условия хранения реагента.

3. В каком биологическом материале определяют активность α-амилазы? В течение какого времени в исследуемом материале сохраняется активность α-амилазы?

4. Требования к процедуре измерения активности α-амилазы. Почему важно строго соблюдать температуру при проведении анализа?

5. Что важно учитывать для предупреждения загрязнения исследуемых проб?

6. Сделать расчет активности α-амилазы в исследуемой сыворотке крови больного, если были получены следующие значения (при температуре 37^оС): А₁ = 0,02; А₂ = 0,06; А₃ =0,08 в течение 3-х минут. Сравнить полученный результатт с нормой. КДЗ определения α-амилазы в сыворотке крови.