Кинетический метод определения активности лактатдегидрогеназы

Принцип метода. Кинетический метод определения каталитической активности ЛДГ основан на ферментативной реакции:

Пируват + НАД·Н + Н^{+ ЛДГ} Лактат + НАД⁺

Уменьшение концентрации НАДН₂ (оптической плотности при λ=340 нм) пропорционально активности ЛДГ – прямой оптический тест Варбурга. Реактивы (по наборам НТПК «Анализ –Х», Беларусь). № 1. Трис- буфер, рН=7,5 (37^оС), 1 флакон – 105 мл. № 2. НАДН₂ – 10 флаконов на 10,5 мл разведений каждый. № 3. Пируват натрия – 2 флакона на 2,5 мл разведения каждый. Приготовление растворов. Раствор 1. Содержимое флакона № 2 растворяют в 10,5 мл буферного раствора из флакона № 1, хранят в темном месте при 2-8^оС в течение недели. Раствор 2. Содержимое флакона с реактивом 3 растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды. Хранят в темном месте при 2-8^оС в течение трех недель. Оборудование. Спектрофотометр с термостатируемой на 37^оС кюветой 1 см. Материал для исследования. Свежая сыворотка или гепаринизированная плазма крови без следов гемолиза.

Проведение анализа. Перед определением температура растворов 1 и 2 должна быть доведена до температуры 25^оС (до комнатной температуры). В термостатированной кювете смешивают 1 мл раствора 1 и 20 мкл (0,02 мл) сыворотки/плазмы крови. Смесь инкубируют 5 минут при температуре 37^оС. Затем в кювету добавляют 50 мкл (0,05 мл) раствора 2. Замеряют оптическую плотность раствора (абсорбцию) по отношению к воздуху или воде точно через 60 (А₁) и 180 (А₂) секунд с момента добавления в кювету раствора 2. Рассчитывают изменение оптической плотности за 1 мин:

ΔА/мин = (А₁ - А₂)/2.

Расчет. Активность ЛДГ в исследуемой пробе в МЕ/л определяют по формуле: МЕ/л = [ ΔА/мин ] · 8600 где 8600 – фактор (Ф), рассчитанный с учетом объема реакционной смеси и биологического материала, толщины кюветы, ммолярного коэффициента экстинции НАДН₂: Ф = (V · 1000)/ (ε · L · v), где V – объем реакционной смеси, мл.

1000 – коэффициент пересчета миллимоль в микромоль.

ε – миллимолярный показатель поглощения НАДН₂ в реакции = 6,22 л/(ммоль·см).

L – длина оптического пути = 1 см.

v – объем пробы (сыворотки крови или плазмы), мл.

Область определения линейна до 1500 МЕ/л. Пробы, содержащие ЛДГ с активностью выше 1500 МЕ/л, разводят 0,9 % NaCl в соотношении 1:9, полученный результат умножают на 10.

Нормальные величины: 174-516 МЕ/л.

Примечание. Для преобразования размерности МЕ/л в нкат/л (нмоль/(с·л) используют коэффициент 16,67; для перевода размерности МЕ/л в нмоль/(ч·л) применяют коэффициент пересчета 0,06.

Влияющие факторы. Завышенные результаты по определению активности ЛДГ могут быть получены при анализе гемолизированного образца сыворотки крови, вследствие высокой активности ЛДГ эритроцитов. Некоторые обезболивающие препараты, этанол, наркотические анальгетики, сульфаниламиды, кодеин, кофеин, анаболические стероиды приводят к повышению активности ЛДГ. Оксалаты (используемые в качестве антикоагулянтов) и мочевина уменьшают активность ЛДГ.

Литература: «Методы клинических лабораторных исследований». Под ред В.С.Камышникова. М., МЕДпресс-информ, 2009.