Оптический тест Варбурга

В основу теста положены различия спектров поглощения света восстановленной и окисленной формами кофермента НАД (никотинамидадениндинуклеотид) (Рис. 3).

А бсорбция (ед. опт. Пл./мл)

0 ,4

0,2

2.

1.

λ (нм)

280 300 320 340 360

Рис 3. Спектр поглощения НАДН (1) и НАД⁺ (2).

При длине волны 340 нм НАДН₂ обладает способностью к поглощению света, тогда как НАД – практически его не поглощает. Молярный коэффициент экстинции (ε) для НАДН при λ=340 нм равен 6220 л/(моль·см) – поглощение 1М раствора при длине пути света 1 см.

Различают прямой и непрямой оптический тест Варбурга:

а) при прямом оптическом тесте в инкубационную среду добавляют кофермент НАДН₂, буферный раствор, источником фермента служит исследуемый материал – чаще всего сыворотка или плазма крови. Например, определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в плазме (сыворотке) крови: в основе данного кинетического метода лежит измерение уменьшения восстановленной формы кофермента НАДН₂ в ходе следующей реакции

п ируват + НАДН₂ ^ЛДГ лактат + НАД (при рН = 7,4-7,8)

б) непрямой оптический тест Варбурга включает в себя основную и индикаторную реакции. Например, кинетический энзиматический метод определения активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) представляет собой сопряжение этих реакций:

Основная реакция – катализируется алт исследуемого образца плазмы крови

α -кетоглутарат + аланин ^АЛТ глутамат + пируват

индикаторная реакция - катализируется ЛДГ в качестве аналитического реактива

п ируват + НАДН₂ ^ЛДГ лактат + НАД

Расчет активности фермента с использованием теста Варбурга

В методах с использованием оптического теста Варбурга расчет активности фермента проводят по формуле: Активность (МЕ/л) = ΔЕ / мин · Ф,

где Ф (фактор) = (V · 1000( / (ε · L· v)

или

V · 1000 Δ Е

А ктивность, МЕ/л (Ед/л, U/Л) = · , где

ε · L · v мин

активность фермента, измеряемая в международных единицах (МЕ или Ед или U), определяется как количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в 1 минуту. Каталитическая активность фермента выражается числом единиц, рассчитанных для 1 л биологической жидкости (МЕ/л).

V – объем реакционной смеси, мл.

1000 – коэффициент пересчета ммоль в мкмоль.

ε – миллимолярный показатель поглощения НАДН₂ в реакции = 6,22 л/(ммоль·см).

L – длина оптического пути = 1 см.

v – объем пробы (сыворотки крови или другого материала), мл.

Δ Е/мин – изменение экстинции (оптической плотности) за 1 мин.

Литература.

1. Камышников В.С. Техника лабораторных работ в медицинской практике. МедПресс-информ. 2010, 2-е изд., перераб. и доп. – 336 с.

2. Камышников В.С. Методы клинических лабораторных исследований. МедПрессинформ. 2010. - 752 с.

3. Яковлева Г.Е. Ферменты в клинической биохимии.Информационно-методическое пособие. - Новосибирск: Вектор-Бест. 2005. – 44 с.

4. Камышников В.С. Справочник по клиническо-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т. Минск-Беларусь . 2002. – 896 с.

5. Карпищенко А.И. Справочник. Медицинские лабораторные технологии: в 2 т . СПб.: Интермедика. 1999.

Отделение «Лабораторная диагностика», 2 курс, 4 семестр. Тема: «Энзимодиагностика»