Занятие № 5. Вопросы для самоподготовки.

1. Кинетические методы определения активности ферментов.

2. Оптический тест Варбурга.

3. Правила работы на спектрофотометре.

На занятии студенты знакомятся с кинетическими методами определения активности АЛТ и ЛДГ; решают проблемные задачи.

Литература: Основы биохимии: Учебник/Кухта В.К и соав.-М.: Медицина, 1999. – 114-124. Пустовалова Л.М. Основы биохимии для мед. колледжей. – Ростов н/д: Феникс. 2004. – 110-115. Лекции курса биохимии.

Отделение «Лабораторная диагностика». 2 курс, 4 семестр. Тема: «Энзимодиагностика».

Методическое пособие для самоподготовки студентов Оптические методы количественного анализа.

Наиболее распространенным оптическим методом, который используют в клинико-диагностических лабораториях для определения активности ферментов, является абсорбционная фотометря. Абсорбционный фотометрический анализ основан на физико-химическом свойстве вещества избирательно поглощать монохроматический (определенной волны) поток световой энергии. Приборы, предназначенные для абсорбционной фотометрии, называются оптическими анализаторами или фотометрами (абсорбциометрами). К фотометрам относятся фотоэлектроколориметры (ФЭК) и спектрофотометры (СФ). Колориметрами (колор – цвет, метрия – измеряю) называют приборы, предназначенные для измерения при длине волны в видимой области спектра (400-800 нм). Принцип колориметрии основан на измерении интенсивности окраски раствора анализируемого вещества. Анализаторы, позволяющие работать как в видимой, так и в невидимой области спектра, называются спектрофотометрами (СФ). Эти приборы дают возможность проводить измерения в ультрафиолетовой (190-400 нм), в видимой (400-800 нм) и в инфракрасной (800-2000 нм) областях спектра. С помощью ФК и СФ определяют экстинцию (Е) (оптическую плотность (D) или абсорбцию (A)) исследуемого раствора. Экстинция, согласно закону Ламберта-Бугера-Бера прямо пропорциональна концентрации поглощающего вещества, толщине слоя раствора и молярному коэффициенту экстинции: Е (D, A) = U_o/U = ε·c·l, где U_{o –} интенсивность входящего пучка света, U – интенсивность его после прохождения через раствор; ε – молекулярный коэффициент экстинции, с – концентрация определяемого вещества, l – длина слоя раствора, через который проходит свет.

Единицы обозначения активности ферментов.

Об активности ферментов судят по количеству субстрата, превращенного ферментом в продукт реакции в единицу времени: S + E → P + E. Скорость ферментативной реакции можно определять по изменеию концентрации субстрата или продукта в реакционной смеси.

За 1 единицу активности фермента Международный биохимический союз предложил принимать количество молей субстрата, превращенное ферментом за 1 с. Эта единица (в системе СИ) называется катал: кат = моль/с. Если проводят определение фермента в сыворотке крови или другой биологической жидкости, то добавляют еще – в литре: кат/л = моль/(с·л). Эта величина слишком большая для секунд, поэтому используют дробные величины: мккат, мкмоль и т.д. (10^-3 – ммоль, 10^-6 – мкмоль, 10^-9 - нмоль): мккат/л = мкмоль/(с·л).

Активность фермента также выражают Международной единицей – МЕ/л (Ед/л, U/л): количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин в стандартных оптимальных условиях: МЕ/л = мкмоль/(мин·л).

Для перевода одних единиц активности ферментов в другие пользуются следующими формулами:

1 кат = 6·10⁷ МЕ; 1 МЕ = 16,67·10⁹кат, или

1 МЕ/л = 0,06 ммоль/(ч·л) = 0,01667 мкмоль/(с·л) =16,67 нмоль/(с·л)

1 мккат/л = 3,6 ммоль/(ч·л) = 60 Е/л

1 ммоль/(ч·л) = 0,28 мккат/л

Методы определения активности ферментов.

Для каждой ферментативной реакции можно построить кинетичнскую кривую, которая отражает изменение концентрации продукта в процессе реакции (рис. 1):

Е (D, А)

(продукт) Скорость реакции в данный момент времени определяют как наклон касательной к кинетической кривой в данной точке

tgα= ΔE/Δt

линейный участок t, мин

Рис. 1. Общий вид калибровочного графика.

Из кривой видно, что скорость реакции на различных участках кинетической кривой, т.е. в различные промежутки времени, отличается. Активность фермента определяют при насыщающей концентрации субстрата. Активность фермента численно равна скорости ферментативной реакции в оптимльных условиях на начальном линейном участке кинетической кривой. Концентрация фермента при этом должна в 5-10 раз превышать К_m (константа Михаэлиса) для данной реакции. При этом, все факторы (рН, температура, присутствие активатора или ингибитора), влияющие на скорость ферментативной реакции, влияют и на активность фермента.

Методы определения активности ферментов могут быть подразделены на 2 основные группы: методы «конечной точки» и кинетические методы.

1. Методы «конечной точки» (колориметрические методы). Они заключаются в измерении оптической плотности на линейном участке кинетической кривой по истечении определенного четко фиксированного отрезка времени t от начала реакции (внесения исследуемой пробы в реакционную смесь). Сыворотку крови (содержит определяемый фермент) инкубируют с субстратом реакции в соответствующем буфере в течение определенного времени. Через фиксированный промежуток времени ферментативную реакцию резко обрывают (рис 2.), используя при этом агрессивные реагенты – кислоты, щелочи, спирты и др. Отсюда и название метода – «по конечной точке», т.е. с остановкой реакции. Далее проводят химическую реакцию на продукт реакции с образованием цветного соединения, концентрация которого пропорциональна активности фермента в сыворотке крови. Определяют оптическую плотность окрашенного раствора на ФЭК. Этот способ применяют в большенстве рутинных методов (в методе Райтмана-Френкеля, сахарогенном методе определения α-амилазы , при определении активности фосфатаз и т.д.).

2. Кинетические (спектрофотометрические) методы; принцип кинетических методов сводится к определению скорости ферментативной реакции за определенные промежутки времени. Скорость реакции – это скорость, с которой изменяется во времени концентрация субстрата или кофермента (под действием фермента она уменьшается), или скорость, с которой увеличивается концентрация продукта реакции. Для того, чтобы измерить скорость ферментативной реакции, необходимо «запустить» реакцию в определенное время, быстро смешав реагенты, а затем, при строго фиксированных условиях температуры и рН, измерять концентрацию продукта реакции или субстрата через определенные промежутки времени. По данным измерения строят кинетическую кривую (рис. 1), которая строится по данным измерения нескольких точек. Она отражает изменение концентрации продукта (или субстрата, или кофактора) в течение реакции. Обычно замеряют начальную, линейную часть кинетической кривой ферментативной реакции, а затем – через равные промежутки времени, фиксируя оптическую плотность реакционной смеси. Анализ проводится непосредственно в фотометре, в термостатируемой кювете (при постоянной температуре - 30 или 37⁰С). Экстинцию реакционной смеси измеряют через равные промежутки времени (двухточечные и многоточечные варианты анализа) (рис. 2).

а . б. в.

t Время время t Время время t t t Время задержки задержки Рис. 2. Измерение скорости ферментативной реакции: а. – «по конечной точке»; б. – двухточечное (twо point metod); в. - многоточечное (kinetic measure-ment).

На основании полученных экстинций в начале и в конце исследования вычисляют разность экстинций ΔЕ и делят ее на промежуток времени регистрации реакции в минутах Δt. Данное отношение является характеристикой кинетики ферментативной реакции (tg α = ΔE / Δt). В окончательном виде формулу для расчета активности фермента в кинетическом методе можно представить следующим образом: (ΔЕ/ Δt) · F, где F (Ф) – фактор (коэффициент), рассчитанный из необходимости дополнительных параметров для каждой конкретной методики с учетом объема реакционной смеси и биологического материала, толщины кюветы, молярного коэффициента экстинции реагента. Как правило, F (Ф) указан в инструкции к методу определения активности фермента. Значение фактора вводится в программу фотометра или биохимического анализатора, по которой рассчитывают активность фермента.

Большинство кинетических методов основано на оптическом тесте Варбурга.