Реактиви, сировина, матеріали

• Покривні і предметні скельця;

• Чашки Петрі;

• Фільтрувальний папір;

• Бактеріо­логічна петля;

• Бактеріоло­гічна голка;

• Мікроскоп МБР – 1;

• МПБ в пробірках 5-, 10-, 20 %-ю концентрацією NaCl і без нього;

• Бактерії спороутворювальні і неспороутворювальні;

Контрольні запитання

1. Для яких цілей використовують поживні сере­довища?

2.На які групи поділяються поживні середовища?

3.Використання елективних і диференційно­діагностичних середовищ.

4.Що таке агар і желатин?

5.Що таке стерилізація і пастеризація?

6.Схарактеризуйте умови стерилізації поживних середовищ.

7. За яких умов здійснюється стерилізація лабо­раторного посуду?

Лабораторна робота № 4

Методи роботи з мікроорганізмами

Мета роботи – опанувати порядок посіву та пересіву мікроорганізмів

Основні теоретичні положення

1 Порядок проведення посіву та пересіву мікроорганізмів.

Для виділення мікроорганізмів з виробничих і природних суб­стратів, підтримки в активному стані чистих культур, приготуван­ня культур з метою передачі у виробництво і тл. у лабораторній практиці користуються методами посіву та пересіву. Посівом, або інокуляцією, називається внесення мікробного матеріалу в сте­рильне поживне середовище. Пересів - це перенесення вироще­ної на поживному середовищі культури мікроорганізмів на інше стерильне поживне середовище. Під час посіву (пересіву) мік­роорганізмів потрібно дотримуватися таких правил (рис 1):

1. Запалити спиртівку або газовий пальник.

1. У ліву руку взяти дві пробірки: одну - зі стерильним сере­довищем, іншу (ближчу до себе) - з культурою, які тримають у нахиленому положенні. Великим і вказівним пальцями правої руки тримати бактеріологічну петлю, простерилізовану у по­лум'ї пальника.

3. З обох пробірок вийняти ватні пробки, притиснути Їх мі­зинцем і безіменним пальцем правої руки до долоні та обпалити краї пробірок, стежачи за тим, щоб пробки не торкалися сторонніх предметів.

4. Петлю ввести у пробірку з культурою, яку пересівають.

Обережно, не торкаючись стінок, відібрати краплю рідкої куль­тури. У разі проведення пересівання із скошеного шару агари­зованого середовища для охолодження петлі спочатку доторк­нутися нею до поверхні середовища, де немає культури, після чого взяти невелику кількість мікробної біомаси.

5. Не торкаючись стінок пробірки, петлю з мікроорганізмами ввести у пробірку й сполоснути у стерильному рідкому середовищі. У разі внесення клітин, взятих петлею зі щільного середови­ща, матеріал ретельно розтерти по стінці пробірки і верхньому краю рідкого середовища, весь час змиваючи його середовищем.

Якщо проводять пересівання на щільне поживне середовище (скошений шар агаризованого середовища), петлю з клітинами мікроорганізмів опускають до дна пробірки, де скупчується не­велика кількість конденсаційної води. Злегка торкаючись пет­лею поверхні косяка, але не руйнуючи його, проводять зигзагоподібний штрих.

6. Петлю вийняти, обпалити краї пробірок і внутрішні кінці пробок, після чого пробірки закрити.

7. Петлю знову прожарити у полум’ї пальника.

7. На пробірці зазначити назву культури і дату посіву (під­пис зробити чорнилом або олівцем по склу). Засіяні пробірки вмістити у термостат для вирощування при оптимальній для цього виду культури температурі.

Описані прийоми слід виконувати біля полум'я пальника для запобігання забрудненню культур сторонніми мікроорганіз­мами. Не можна робити різких рухів, ходити тощо біля того, хто працює з чистою культурою, оскільки рух повітря посилює не­безпеку випадкового зараження культури та середовища. Пере­сівати мікроорганізми краще в стерильному боксі.

1 2

3 4

5

Рис.1 Пересів культури мікроорганізму:

1 – обжарювання петлі; 2 – набір культури; 3 – посів культури; 4 – обжарювання країв пробірок; 5 – обжарювання петлі.

Посів у рідке середовище можна робити петлею або піпеткою (пастерівською або градуйованою). Обидві пробірки тримають у злегка похиленому положенні, щоб не замочити ватяні про­бки. Петлю з мікробним матеріалом опускають безпосередньо в стерильне середовище й обполіскують. При внесенні клітин, узятих петлею зі щільного середовища, матеріал ретельно роз­тирають по стінці пробірки у верхнього краю рідкого середови­ща, весь час змиваючи його середовищем.

Посів на щільні середовища. Посіви петлею на скошеному агаризованому середовищі роблять зиrзаrоподібним штрихом, вільно ковзаючи петлею по поверхні щільного середовища від одного краю пробірки (чашки Петрі) до іншого; або прямою рискою, для цього петлею проводять пряму лінію знизу догори посередині поверхні поживного середовища або суцільним посі­вом, розтираючи матеріал обережними круговими рухами по всій поверхні середовища.

Рис.2 Посів уколом

Посів у чашки Петрі роблять у такий спо­сіб: щільне поживне середовище у пробірках або колбах розплавляють у киплячій водяній бані, охолоджують до 48-50 ºС і, дотримую­чись правил стерильності, розливають рів­ним шаром товщиною 10-15 мм у стерильні чашки. Застигле середовище можна злегка підсушити в термостаті. Посів роблять скля­ним шпателем Дригальского або петлею у вигляді паралельних або зиrзаrоподібних штрихів (метод виснажливого штриха).

У стовпчик агаризованого середовища посів роблять уколом (рис.2).

Засіяні і підписані пробірки, колби або чашки Петрі ставлять у термостат для вирощування.

2 Методи одержання накопичувальних культур

Накоnичувальнuми (елективнuми) називають культури, в яких переважають представники близьких видів або навіть одного роду мікроорганізмів. Для одержання таких культур створюють умови, що забезпечують переважний розвиток виду, який виділя­ють. Для цього використовують селективні середовища, а та­кож варіюють такими факторами, як рН, температура, окисно- відновний потенціал, вводять певні антибіотики та ін. Так, з6ільшуючи кислотність середовища, усувають можливість роз­витку бактерій і створюють сприятливі умови для розмноження дріжджів і міцеліальних грибів. Одержання накопичувальних культур термофільних організмів здійснюють при температурі 45-65 ºС, рідше при 70-75 ºС.

Внесення в середовище певних концентрацій пеніциліну сприяє розвиткові грамнегативних бактерій або дріжджів. Не­оміцин або пеніцилін спільно зі стрептоміцином придушують бактеріальну мікрофлору і створюють умови для переважного розвитку дріжджів. Ністатин, навпаки, перешкоджає життє­діяльності дріжджів, не впливаючи на бактерії.

Для одержання накопичувальних культур аеробних мікро­організмів поживне середовище наливають тонким шаром (1,5­ - 2 см) у колби і культивують на качалках. Для збагачення анае­робними мікроорганізмами середовища розливають доверху у високі пробірки або флакончики з притертими пробками. У результаті повторних пересівань на те саме елективне середовище і створення сприятливих умов для видів культура поступово збагачується мікроорганізмами з бажаними властивостями і збіднюється супутніми формами.

3 Методи виділення чистих культур

Вивчати морфологічні, культуральні, фізіологічні особливості мікроорганізмів, застосовувати мікроорганізми на виробництві можна за наявності чистих культур. Чиста культура - це попу­ляція генетично споріднених клітин, одержаних із однієї бать­ківської клітини.

Найчастіше чисту культуру виділяють з елективних культур.

Після одержання елективної культури розпочинають виді­лення чистої культури. Існує декілька методів виділення чистих культур. Вони всі грунтуються на ізолюванні від мікробної по­пуляції однієї клітини (однієї колонії).

Виділення чистої культури з однієї колонії. Цей метод упро­вадив у мікробіологічну практику німецький учений Роберт Кох. Для виділення необхідно мати три-чотири стерильні чаш­ки Петрі, пробірки або колбочки з щільними поживними сере­довищами, петлю або стерильну піпетку, шпатель Дригальсько­го, елективну культуру, пальник. Перед початком роботи стіл протерти ватним тампоном, змоченим у спирті, ретельно вими­ти і продезінфікувати 70 % розчином спирту руки.

ІЦільні поживні середовища розплавити у киплячій водяній бані, охолодити до температури 45-50 ºС і розлити у чашки Петрі. Для цього колбу або пробірку з середовищем взяти пра­вою рукою, тримаючи в похилому положенні, вийняти ватну пробку. Горловину посудини обпалити у полум'ї пальника і, відкривши великим і вказівним пальцями лівої руки кришку чашки Петрі, швидко вилити розплавлене середовище (15­-20 см^З) так, щоб дно чашки було повністю ним покрите. Кришку відразу закрити, чашки залишити в горизонтальному положен­ні на столі до повного застигання середовища.

За поверхневого способу виділення аеробних мікроорганізмів краплю культури або її розбавлення нанести петлею чи піпет­кою в центр застиглого середовища, трохи відкриваючи кришку чашки Петрі. Обережно розтерти її стерильним шпателем Дри­гальського по всій поверхні середовища в чашці, після чого цим самим шпателем із залишками матеріалу протерти поверхню се­редовища послідовно в другій, третій, рідше - у четвертій чаш­ці Петрі. При цьому кришка кожної чашки має бути відкритою настільки, щоб у щілину міг пройти лише шпатель. Після закін­чення роботи скляний шпатель вмістити у дезінфікувальний розчин.

Розсівати елективну культуру на поверхню поживного сере­довища можна і петлею (рис. 3).

Рис.3 Розсів культури мікроорганізмів на поверхню поживного середовища:

а) – шпатель Дригальского; б) – розсів; в) – ріст мікроорганізмів після розсіву шпателем; г) – ріст мікроорганізмів після розсіву петлею (в трьох чашках); д) – ріст мікроорганізмів після розсіву петлею (в одній чашці).

Отже, таким способом можна виділяти чисті культури ви­робничих дріжджів, бражки, молока, води, пива, вина, квасу, тіста, Грунту, змивів сировини тощо, заздалегідь підготувавши розбавлення у стерильній воді або у фізіологічному розчині (0,85 %-й розчин натрію хлориду).

Після розсіву чашки Петрі підписати, перевернути догори дном, щоб утворена під кришкою конденсаційна вода не капала вниз і не розмивала ізольовані колонії. Чашки Петрі витримувати 2-7 діб у термостаті, оскільки швидкість росту у різних мікроорганізмів неоднакова, і щодня їх переглядати. Кожна клітина залишається на тому самому місці середовища, куди вона потрапила в момент розсіву. Тут клітини матимуть сприятливі умови для свого розвитку, починають розмножуватися й утво- рюють колонії, тобто виникає дуже велика кількість клітин одного виду. Колонії, що виросли, оглядають спочатку неозброєним оком, а потім за допомогою лупи і під мікроскопом.

При огляді колоній звертати увагу на форми і розмір колоній, їхнє забарвлення і забарвлення субстрату, характер поверхні колоній та їхніх країв, вид колоній та ін. Ізольован колонію, що відрізняється від інших зовнішніми ознаками та міститься на відстані не менш як 1 см від інших колоній, відсія­ти стерильною петлею в окрему пробірку з рідким середовищем або на поверхню скошеного твердого середовища.

Мікроорганізми, які належать до факультативних анаеробів, найчастіше виділяють глибинним посівом. Для цього розплавле­ні агаризовані поживні середовища слід розлити по 15-20 см^З У пробірки і простерилізувати. Безпосередньо перед виділенням чистої культури середовища в пробірках розтопити у водяній бані. Після охолодження до температури 48-50 ºС стерильною петлею внести краплю елективної культури у першу пробірку, закрити її ватною пробкою, вміст перемішати, після чого дві-три краплі суміші перенести у другу пробірку. Потім п'ять-шість крапель з другої пробірки перенести у третю. Таким чином одержують ряд розбавлень посівного матеріалу, який після пе­реміщування між долонями обох рук стерильно виливають у чашки Петрі. Середовище з мікроорганізмами розподілити рів­ним шаром по дну кожної чашки і поставити на горизонтальну поверхню для застигання. При цьому працювати з агаризовани­ми середовищами слід швидко, оскільки при температурі 40 ºС вони застигають.

Для виділення анаеробних мікроорганізмів за методом Коха необхідно обмежити доступ кисню до культури. З цією метою поверхню глибинного посіву в чашці Петрі заливають стериль­ною сумішшю парафіну і вазеліну (1:1). Можна використовува­ти спеціальні стерильні трубки довжиною 20-30 см і діаметром 0,4-0,7 см, зроблені за типом піпеток Пастера. Після заповнен­ня трубки сумішшю розбавлення накопичувальної культури і розплавленого й охолодженого поживного середовища трубку запаюють із двох сторін (з боку капіляра й у місці перетяжки). Можна залишати посівний матеріал, ретельно перемішаний з агаризованим, добре освітленим поживним середовищем, без­посередньо в звичайній пробірці. Ватяну пробку заміняють гумовою або заливають поверхню агару сумішшю парафіну і ва­зелінової олії. Щоб дістати вирослі колонії анаеробних мікро­організмів, пробірки або трубки злегка нагрівають, швидко обертаючи над полум'ям пальника. Агар, що прилягає до стінок, розплавляється, і стовпчик вислизає в підготовлену стерильну чашку Петрі. Стовпчик агару розрізають стерильним ланцетом, колонії витягають стерильною петлею або стерильною капіляр­ною трубкою і переносять у рідке середовище.

4 Приготування препаратів мікроорганізмів

Препарати го­тують на предметних скельцях і накривають зверху покривними­. Предметні скельця - це пластинки (76х26 мм) з тонкого скла з добре відшліфованими краями і товщиною, що не пере­щує 1,2-1,4 мм. Більш товсті скельця порушують фокусуван­ня конденсора і знижують чіткість зображення, що утруднює роботу з імерсійним об'єктивом. Покривні скельця мають такі розміри: 18х18, 20х20, 18х24 мм тощо при товщині 0,15-0,17. Покривні скельця більшої товщини погіршують якість зображ­ення.

Предметні та покривні скельця мають бути чистими і ре­тельно знежиреними, що особливо важливо при готуванні фікс­ованих препаратів. Для перевірки чистоти скла на його повер­хню наносять краплю води. При достатньому знежиренні крапля розтікається рівномірно і не збирається в опуклі пухирці, що повільно висихають. Використані скельця витримують 1-2 год у хромовій суміші (1 л води, 50 г калію дихромату, 100 г техніч­ної сульфатної кислоти), після чого обполіскують теплою водо­ю і спиртом. У повсякденній роботі для вилучення жиру

Предметні скельця натирають шматочком мила, а потім витира­ть чистою бавовняною серветкою.

Зберігають чисті предметні скельця в сухому стані або в бан­ках із притертими пробками, заповненими 96 %-м спиртом або сумішшю Никифорова. Виймати скельця варто пінцетом, тому що пальці залишають на їхній поверхні жирні плями. Перед уживанням скельця варто просушити на повітрі або протерти фільтрувальним папером, чистою тканиною. Покривні скельця повинні бути також добре вимиті, висушені і зберігатися в спе­ціальних коробках або чашках Петрі.

5 Відбір культури для дослідження.

Мікроорганізми в лабо­раторних умовах вирощують у пробірках, колбах, чашках Петрі на щільному або рідкому поживному середовищах. Для відбору клітин із рідкого середовища використовують стерильні бак­теріологічні петлі або піпетки. Мікроорганізми, що виросли на щільному середовищі, беруть петлями або препарувальними голками. При відборі необхідно дотримуватися таких правил, що запобігають забрудненню культури сторонніми мікроор­ганізмами:

Запалюють спиртівку або газовий пальник.

Пробірку з вихідною культурою в рідкому середовищі обережно обертають між долонями, а потім поміщають у ліву руку між великим і вказівним пальцями і тримають у похилому положенні. Якщо культура вирощена в щільному середовищі, поверхня з культурою мікроорганізмів має бути оберненою до­гори і добре видною.

3. Петлю тримають вертикально в полум'ї пальника і прожа­рюють до почервоніння дріт, потім нахиляють і обпалюють час­тину тримача, що примикає до неї.

4. Мізинцем і безіменним пальцями правої руки притиска­ють до долоні зовнішню частину ватяної пробки, виймають її з пробірки і тримають у такому положенні, не торкаючись навко­лишніх предметів.

Край відкритої пробірки обпалюють у полумrі пальника.

Обережно вводять стерильну петлю в пробірку з куль­турою. Щоб не пошкодити клітини на щільному середовищі, петлю спочатку охолоджують, доторкнувшись до внутрішньої поверхні пробірки або поживного середовища, вільного від мік­роорганізмів. Легким рухом відбирають невелику кількість мікробної маси або краплю рідини з клітинами. Виймаючи пет­лю з пробірки, стежать за тим, щоб матеріал не торкався її сті­нок або країв.

7. Знову обпалюють у полум'ї пальника край пробірки, потім внутрішній кінець ватяної пробки і пробірку закривають. Якщо ватяна пробка займеться, на неї не дмухають і її не кидають, а негайно вводять усередину пробірки і затискають тліючі місця рукою.

8. Пробірку з культурою ставлять у штатив, а відібраний ма­теріал використовують для приготування препарату.

9. Клітини мікроорганізмів, що залишилися на петлі, спалю­ють у полум’ї пальника.

Відбір культур мікроорганізмів, що виросли на щільному се­редовищі в чашці Петрі, роблять у тій же послідовності: запа­люють пальник, стерилізують петлю (або голку), після чого від­кривають великим і вказівним пальцями лівої руки кришку чашки Петрі. Уводять стерильну петлю під кришку і торкають­ся нею поверхні середовища, вільної від колоній. Гаряча петля зумовлює розплавлення середовища. Знімають з поверхні неве­лику кількість мікробних клітин, кришку чашки негайно закривають. Матеріал на петлі використовують для приготування препарату або посіву. Прожарювання петлі (голки) знищує клі­тини, що залишилися на ній. При прожарюванні мокрої петлі може відбуватися розбризкування дрібних крапельок рідини разом з мікробними клітинами, тобто утвориться аерозоль. Тому прожарювання петлі починають з ділянки дроту, що пере­дує кільцю. Клітини, що залишилися на петлі, підсихають, три­мач переводять у вертикальне положення і прожарюють петлю.

З рідкого середовища мікроорганізми можна відбирати гра­дуйованою або пастерівською піпеткою. При використанні пас­терівської піпетки стерильним пінцетом надломлюють її тонкий запаяний кінець і злегка обпалюють усю піпетку. Стерильні пі­петки, загорнені в папір, виймають за верхній кінець, закритий ватяним тампоном. Колбу (пробірку) з рідкою культурою бе­руть у ліву руку, піпетку - в праву між великим і середнім паль­цями, затискаючи її верхній отвір вказівним пальцем. Якщо в піпетці рідини недостатньо, її набирають за допомогою гумової груші. Відібрану пробу використовують для приготування пре­паратів або посіву в нове поживне середовище. Не можна стави­ти брудну піпетку у штати в або торкатися нею навколишніх предметів. ЇЇ слід негайно опустити в дезинфікуючу рідину (0,5-3 %-й водний розчин хлораміну або З-5 %-й водний роз­чин фенолу).

6 Приготування препаратів живих клітин.

Живі мікроор­ганізми можна спостерігати в препаратах «роздавленна» і «висяча крапля». Для приготування препаратів у вигляді «роздавленної краплі» на середину чистого предметного скла нанести маленьку краплю води, перенести в неї невелику кількість досліджуваних мікроорганізмів, добре перемішати і накрити покривним склом. Якщо досліджувані мікроорганізми ростуть на щільному поживному середовищі, мікробну масу перенести у підготовле­ну краплю води за допомогою петлі, якщо в рідкому середови­щі - суспензію клітин нанести на предметне скло стерильною піпеткою або за допомогою петлі, краплю води на предметне скло можна не наносити. Крапля з досліджуваним матеріалом має бути невеличкою, щоб після притискання її покривним склом з-під останнього не виступала зайва рідина. Зайву рідину видалити фільтрувальним папером. Підготовлений препарат помістити на столик мікроскопа, закрити затискачами. Препа­рат «роздавлена крапля» допомагає встановити форму, розміри клітин, їх розмноження, рухомість, наявність спор, реакцію клі­тин на хімічні подразники.

Для приготування препарату «висяча крапля» невелику краплю суспензії мікроорганізмів нанести на покривне скло, пе­ревернути його краплею донизу і помістити на спеціальне пред­метне скло із заглибленням у центрі. Краї заглиблення заздале­гідь змастити вазеліном. Крапля має висіти вільно, не торкаю­чись країв і дна заглиблення. Це дозволяє її вивчати впродовж кількох днів, спостерігаючи за ростом і розмноженням мікроор­ганізмів, утворенням і проростанням спор, рухомістю клітин.

Препарат «відбиток» готують для вивчення природного роз­ташування в колонії клітин стрептоміцетів і міцеліальних гри­бів. Зі щільного середовища, на якому мікроорганізми ростуть суцільним газоном у вигляді колоній, вирізують скальпелем не­великий кубик або окрему колонію і переносять на предметне скло. Поверхня з мікроорганізмами має бути обернена догори. Потім прикладають чисте покривне скло, злегка надавлюють на нього петлею або голкою і негайно ж знімають, намагаючись не зрушити убік. Препарат поміщають відбитком вниз у краплю води або в розчин метиленової сині (1:40) на предметному склі і мікроскопують.

Фарбування живих клітин. Для виявлення деяких функціо­нальних особливостей клітин і диференціації їхніх включень за­стосовують прижиттєве фарбування мікроорганізмів. Через токсичність барвників живі клітини фарбують нейтральним червоним, нейтральним фіолетовим, метиленовою синню, фук­сином, еозином, еритрозином, у дуже невели­ких (0,001-0,0001 %) концентраціях. На предметному склі краплю досліджуваних мікроорганізмів змішують із краплею розчину барвника, накривають покривним склом і через 2-3 хв мікроскопують.

Уявлення про природну форму, величину, будову мікроор­ганізмів, їхні окремі структури (позаклітинний слиз) дають не­гативні препарати. Для негативного фарбування застосовують рідку туш, 3 %-й водний розчин конго червоного, 10 %-й розчин нігрозину й інші барвники, що не проникають у мікробні кліти­ни. Краплю туші або розчину барвника змішують із краплею культури, накривають покривним склом і розглядають із сухи­ми об'єктивами. Барвники заповнюють простір, що оточує клі­тину, і в результаті незабарвлені мікроорганізми чітко виділяються у вигляді яскраво освітлених безбарвних капсул на тем­ному тлі препарату. Можна застосувати комбіноване негативне фарбування фону з прижиттєвим фарбуванням клітин.

7 Приrотування препаратів фіксованих і пофарбованих клітин

Фіксованими вважають клітини мікроорганізмів, у яких пе­рервані життєві процеси, але цілком збережена тонка структура. Пофарбовані фіксовані клітини і деталі їхньої будови різкіше виділяються на фоні препарату. Це полегшує вивчення форми, розмірів, внутрішніх елементів (ядра, оболонки, спор, вклю­чень), спрощує підрахунок кількості клітин. Фіксовані препара­ти звичайно розглядають з імерсією. Приготування таких пре­паратів має такі етапи: приготування мазка, висушування, фік­сація та фарбування.

Приготування мазка. На знежирене предметне скло нанести маленьку краплю очищеної води і петлею перенести в неї неве­лику кількість досліджуваного матеріалу, як для препарату «роздавлена крапля». Одержану суспензію рівномірно розподі­лити петлею або краєм покривного скла на площі 1-2 см² яко­мога тоншим шаром, щоб вона висихала майже відразу після приготування мазка.

Сушіння мазка. Найкраще сушити препарат при кімнатній температурі на повітрі. Якщо мазок висихає повільно, препарат можна злегка нагрівати у струмені теплого повітря, тримаючи скло високо над полум'ям пальника мазком догори. Цю опера­цію слід виконувати дуже обережно, не перегріваючи мазок, інакше клітини мікроорганізмів деформуються.

Фіксація. Цей процес має на меті вбити мікроорганізми, тобто зробити їх безпечними, якщо вони патогенні; забезпечити найкраще прилипання клітин до скла, зробити мазок більш сприятливим до фарбування (мертві клітини забарвлюються краще, ніж живі). Поширений спосіб фіксації - термічна оброб­ка. Для цього препарат треба тричі пронести через найгарячіше полум'я пальника, тримаючи предметне скло мазком догори. Не слід сильно перегрівати мазок, оскільки можуть статися грубі зміни зовнішнього вигляду клітини і внутрішніх клітинних структур (зморщування). Іноді застосовують хімічні способи фіксації: занурюють предметне скло з мазком у мензурку з 96 %-м етанолом на 15-20 хв, з безводним метанолом на З-5 хв, з розчином Никифорова на 15-20 хв, із сумішшю 96 %-го ета­нолу і 40 %-го формаліну (співвідношення 95:5) на 2 хв. Можна фіксатор наливати безпосередньо на мазок і витримувати зазна­чений час. Після закінчення фіксації мазок обережно промива­ють легким струменем здистильованої води й фарбують.

Фарбування. Розрізняють прості, складні і диференціальні способи фарбування мікроорганізмів. При простому фарбуванні частіше використовують один барвник і профарбовують усю клітину. Це дає можливість чітко визначити форми і розміри клітин. Складне фарбування передбачає застосування двох або декількох барвників, наприклад, діагностичне визначення відно­шення бактерій до фарбування за Грамом. Диференціальне фар­бування засноване на індивідуальному відношенні біологічних структур клітин до різних барвників (фарбування спор, оболон­ки, ядра капсул, метахроматина й ін.).

Фіксований препарат вмістити на паралельні скляні мости­ки, які лежать на стінках кристалізатора, і облити з піпетки кількома краплинами розчину вибраного барвника. Слід зверта­ти увагу на те, щоб кінець піпетки не торкався мазка. Тривалість фарбування - від декількох секунд до 1-3 хв. Необхідно сте­жити, щоб під час фарбування розчин барвника на мазку не під­сихав, і у разі потреби доливати нові порції. Після закінчення фарбування препарат промити струменем води доти, доки вода, що стікає, стане безбарвною. Потім препарат висушити на повітрі або обережно промокнути фільтрувальним папером і мікроскопувати з імерсією.

Фарбування ендоспор. Для фарбування ендоспор застосову­ють спеціальні складні методи, тому що багато шарова оболонка і кортекс спори важко проникні для основних барвників. З метою розпушення оболонки ендоспор фарбування мазків проводять сильним барвником при нагріванні, потім цитоплазму знебарв­люють і додатково фарбують у контрастний колір.

Фарбування за методом Пєшкова. Приготовлений тонкий мазок 2-3-добової культури бактерій фіксують на полум’ї паль­ника або сумішшю 5 частин 40 %-го формаліну і 95 частин 96 %-го етанолу впродовж 4 хв. Після фіксації мазок заливають метиленовою синню і доводять до кипіння, тримаючи предметне скло над полум'ям пальника. Тривалість фарбування 10-20 с.

У мipy випарювання додають нові порції фарби. Далі препарат ретельно промивають водою і протягом 30 с дофарбовують 0,5 %-м розчином нейтрального червоного. Знову препарат промивають водою, висушують і мікроскопують з імерсією. Мікро­скопічна картина: спори - блакитні або сині (молоді спори тем­но-сині), цитоплазма вегетативних клітин - рожева або червона.

Фарбування за методом Златогорова. Мазок спороутворювальних бактерій висушують на повітрі. Для фіксації та розпушення оболонок ендоспор мазок не менш 10 разів проводять над полум'ям пальника. На препарат кладуть смужку фільтрувально­го паперу, рясно змочують карболовим фуксином Циля, і нагрівають 8-10 хв до появи пари (але не до кипіння). При цьому важливо, щоб барвник випаровувався, але папір не підси­хав. Тому періодично додають нові порції фарби. Потім папір знімають і 6-10 с препарат знебарвлюють 5%-м розчином суль­фатної кислоти і промивають водою. Вегетативні клітини при цьому знебарвлюються та їх додатково 2 хв фарбують метиленовою синню. Мазок знову промивають, сушать фільтрувальним пером і мікроскопують з імерсією. При правильно виконаних операціях спори фарбуються в яскраво-червоний колір і чітко виділяються на синьому фоні цитоплазми.

Фарбування за методом Леффлера в модифікації Пєшкова. Досліджувану культуру бактерій щодня протягом 2-3 днів пе­ресівають на свіже напіврідке середовище, що містить не більше 0,5 % агару. Клітини петлею обережно переносять У пробірку зі стерильною водою, підігрітою до температури, при якій культу­ра вирощувалася. Краплю отриманої суспензії переглядають під мікроскопом і переконуються, що клітини добре рухливі і щіль­ність суспензії становить 5-10 клітин у полі зору. Перед приго­туванням мазка скло З-4 рази проводять над полум'ям пальни­ка, потім охолоджують і на обпалену поверхню пастерівською піпеткою або петлею наносять З-4 маленькі крапельки приго­товленої суспензії бактеріальних клітин. Крапельки мають розтікатися по склу і швидко висихати. При тривалому виси­ханні бактерії часто втрачають джгутики. Висушений мазок за­ливають протравленням, витримують 15 хв без нагрівання, піс­ля чого протравлення змивають здистильованою водою. Далі препарат фарбують 5 хв розведеним водою фуксином Циля (1:1), занурюючи його мазком вниз у розчин барвника. Пофарбований мазок промивають водою, висушують на повітрі і роз­глядають з імерсією. При мікроскопуванні звертають увагу на розташування джгутиків, Їхню кількість і довжину.

Фарбування капсул у бактерій. Для виявлення капсул засто­совують спосіб негативного контрастування за допомогою чор­ної туші.

1. Негативне контрастування можна комбінувати з прижит­тєвим фарбуванням клітин. Для цього краплю досліджуваної суспензії бактерій вмістити у краплю розбавленого розчину фуксину, потім змішати з краплею туші, накрити покривним склом і мікроскопувати з сухим об'єктивом.

2. Краплю бактеріальної суспензії внести у краплю карболо­вого фуксину і залишити на 3-5 хв. Додати одну краплю туші й витримати з імерсією.

У полі зору на чорному тлі добре помітні червоні бактеріаль­ні клітини і безбарвні капсули.

Фарбування бактерій за Грамом. Метод запропонований данським вченим Грамом у 1884 р. Суть фарбування полягає в тому, що при обробленні генціанвіолетом та йодом у клітинах одних мікроорганізмів (грампозитивних) утворюється стійкий і не розчинний у спирті комплекс, клітини інших мікроорганіз­мів (грамнегативних) після оброблення зазначеними барвника­ми легко знебарвлюються спиртом і набувають червоного коль­ору при подальшому обробленні фуксином.

Здатність забарвлюватися за Грамом залежить від фізико­хімічного складу оболонки цитоплазми і віку культури, тому фарбувати за Грамом завжди слід молоді, найчастіше однодо­бові культури.

Фарбування за Грамом виконують так. На знежиреному предметному склі приготувати три мазки з різних культур. У центр нанести мазок досліджуваного мікроорганізму, ліворуч і праворуч - мазки контрольних мікроорганізмів; грампозитив­ні - стафілококи, сарцини; грамнегативні - кишкова паличка. Мазки висушити на повітрі, фіксувати над полум'ям пальника. На фіксовані мазки покласти смужку фільтрованого паперу і налити розчин карболового генціанвіолету. Мазки фарбувати протягом 1 - 2 хв. Папір з барвником зняти і, не промиваючи водою, обробляти мазок розчином Люголя протягом 1 - 2 хв до повного почорніння. Потім розчин злити, препарат промити во­дою і 30 с обробляти етиловим спиртом для знебарвлення, для чого занурити предметне скло 2-3 рази в склянку зі спиртом або налити спирт на мазок. У цьому разі скло злегка похитувати і спирт змінювати кілька разів. Далі препарат промити водою і додатково забарвити водним розчином фуксину протягом 1- 2 хв. Фуксин злити, препарат знову промити водою, висушити і мікроскопувати з імерсією.

За правильного фарбування грампозитивні бактерії забарвлені в синьо-фіолетовий колір, грамнегативні - в червоний - колір фуксину.