5.2.7 Осаждение белков спиртом

В пробирку наливают 1-1,5 см³ раствора белка и добавляют немного кристаллического хлористого натрия. Приливают постепенно туда же 5-6 см³ этилового спирта. Выпадает хлопьевидный осадок белка вследствие дегидратации белковых молекул при добавлении спирта.

Задания к работе

Записать результаты реакций осаждения белков при действии органических и неорганических осадителей в виде таблицы 5.1.

Таблица 5.1

Название групп осадителей	Используемые реактивы и химические вещества	Характер и цвет осадка	Чем обусловлена реакция

Контрольные вопросы

1. Наличие каких функциональных групп обуславливает взаимодействие белка с солями тяжелых металлов?

2. Какие изменения происходят в структуре белка при нагревании? Меняется ли его первичная структура?

3. Как называется процесс свертывания белков ? Почему свернувшийся белок не растворяется в воде?

4. Что наблюдается при добавлении к белку гидроксида натрия и кислоты?

5. Чем может быть вызвана денатурация белков?

6. От чего зависит заряд белка в водном растворе?

7. Какие реактивы осаждают белки необратимо?

Задания к теме

1. Выберите правильно парные сочетания ключевых слов и смысловых предложений.

А. Нативный белок.	а) вещество, ослабляющее взаимодействие белковых молекул с другими макромолекулами;
Б. Денатурированный белок.	б) один из методов очистки белка;
В. Детергент.	в) индивидуальный белок;
Г. Электродиализ.	г) белок, с присущим ему в естественном состоянии свойствами;
Д. Гомогенный белок.	д) белок, потерявший природные свойства.

2.Выберите правильно парные сочетания ключевых слов и смысловых завершающих предложений.

А) Альбумины.	а) хорошо растворимы в воде;
Б) Протамины.	б) содержит не менее 30 % основных аминокислот;
В) Глобулины.	в) растворяются в 70-80% спирте;
Г) Гистон.	г) не растворяются в воде и солевых растворах умеренных концентраций;
Д) Проламины.	д) содержит 80-90% аргинина.

3.Что такое первичная структура белка?

А) Последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи;

Б) Полинуклеотидная цепь;

В)Макромолекула, состоящая из отдельных полипептидных цепей;

Г)Трехмерная конфигурация закрученной спирали.

4. Какую качественную реакцию дают все белки?

А)Ксантопротеиновая;

Б)Серебряного зеркала;

В)Фелинга;

Г)Нингидриновая.

5. Какую функцию не выполняют белки в организме животных?

А)Транспортную;

Б)Резервную;

В)Структурную;

Г)Регуляторную.

6. Какие связи не участвуют в образовании третичной структуры?

А)Водородные;

Б)Гидрофобные;

В)Сложноэфирные;

Г)Дисульфидные.

Проверь себя

1. Белки-биополимеры, мономерами которых являются:

а) амины; б) β-аминокислоты; в) α-аминокислоты; г) амиды карбоновых кислот.

2. В белках аминокислоты связаны: а) сложноэфирными; б) водородными; в) пептидными; г) гликозидными связями.

3. В изоэлектрической точке пептиды имеют заряд: а) отрицательный; б) положительный; в) нулевой.

4. Между остатками треонина и глутамина при формировании третичной структуры белка возникает связь: а) оинная; б) ковалентная; в) дисульфидная; г) водородная.

Лабораторная работа № 6

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ

АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ И ЭФФЕКТИВНОСТИ

ТЕПЛОВОЙ ОБРАБОТКИ МЯСНЫХ И РЫБНЫХ

КУЛИНАРНЫХ ИЗДЕЛИЙ

Продолжительность работы 4 часа.

Цель работы: исследование активности каталазы в различных растительных объектах и влияния сульфитации на активность каталазы и оценка качества тепловой обработки мясных изделий.

Теоретические положения

Ферментами (энзимами) называют белковые вещества, образующиеся в клетках и тканях организма, обладающие каталитической активностью, способные ускорять протекание химических реакций. Каждый фермент катализирует только одну химическую реакцию. При этом сам фермент разрушается в незначительной степени. Скорость ферментативной реакции зависит от количества и активности фермента, концентрации субстрата, рН и состава раствора, температуры, присутствия активаторов и ингибиторов. Таким образом, ферменты – это биологические катализаторы. Катализ может быть положительным (ускорение реакции) или отрицательным (замедление реакции).

Впервые фермент был открыт в 1814 г. профессором Петербургской академии Кирхгофом. В настоящее время известно более 3000 ферментов.

Ферменты бывают простыми белками (протеинами) и сложными (протеидами). Их молекулярная масса колеблется в широких пределах от 12·10³ до 10·10⁶ Да. Ферменты называют по тому веществу, на которое они действуют, прибавляя к корню «аза» – липаза, лактаза, пептидаза.

С точки зрения локализации ферменты подразделяют на внеклеточные и внутриклеточные. Внеклеточные ферменты выделяются клеткой во внешнюю среду. Многие из них синтезируются микроорганизмами и вызывают расщепление биополимеров. Внутриклеточные ферменты локализованы либо в клеточных органеллах, либо в комплексе с надмолекулярными структурами. Установлено, что в ядре клетки локализованы ферменты, принимающие участие в синтезе РНК и ДНК; с митохондриями связаны ферменты окисления жирных кислот, продуктов распада углеводов; в лизосомах содержатся ферменты гидролиза; с рибосомами связаны ферменты белкового синтеза [Жеребцов].

Так, например разные мышцы в зависимости от функциональных особенностей отличаются концентрацией ферментов. Красные мышцы содержат больше всего митохондрий по сравнению с белыми и отличаются высокой активностью окислительных ферментов [Данилова].

Многим ферментам для эффективной работы требуются те или иные небелковые компоненты, называемые кофакторами. Кофакторы подразделяются на три типа: неорганические ионы, простетические группы и коферменты.

1. Неорганические ионы (активаторы ферментов) заставляют молекулы фермента или субстрата принять форму, способствующую образованию фермент-субстратного комплекса. Так, например, активность амилазы слюны повышается в присутствии хлорид-ионов.

2. Если кофактор прочно связан с ферментом и остается в этом связанном состоянии постоянно, то его называют простетической группой (от греч. prostheke - добавление), роль, которой играют органические молекулы.

3. Коферменты – это органические молекулы (небелковые вещества), легко отделяющиеся от белковой части фермента и способные существовать самостоятельно. Коферментами могут быть металлы, витамины В₁, В₂, В₆, РР, биотин, пантотеновая кислота и др. соединения. Не могут синтезироваться организмом человека и животных. Коферменты термостабильны, а белковая часть – апофермент – термолабильна и легко денатурирует при определенных внешних воздействиях.

От обычных функциональных белков ферменты отличает то, что на поверхности белковой глобулы у них располагается активный центр. Это участок, образованный из (рисунок 6.1) различных аминокислотных остатков, собранных из различных областей полипептидной цепи, где происходит связывание и превращение субстрата. При этом субстратом называется химическое соединение, претерпевающее изменение в ходе каталитического процесса. Кроме активного центра, у некоторых ферментов имеется еще и регуляторный участок. По размерам белковая глобула фермента превышает в несколько раз размеры субстрата.

В активном центре фермента могут располагаться аминокислотные остатки, содержащие различные функциональные группы, которые принимают участие в каталитическом процессе.

Рисунок 6.1 – Активный центр и регуляторный участка на поверхности белковой глобулы фермента

Условно активный центр фермента можно разделить на два участка: сорбционный, функциональные группы которого отвечают за связывание субстрата в активном центре фермента, и каталитический, в котором происходит превращение субстрата. Размер активного центра фермента, определяется размером субстрата (гипотеза «ключа и замка» - субстрат – ключ, фермент – замок, предложенная в 1890 г. Фишером). Константа, характеризующая эффективность превращения субстрата в активном центре фермента называется каталитической (k_kat), а константа, определяющая сродство субстрата к ферменту – константа связывания (K_S ≈ K_m). Действие эффектов (активаторов и ингибиторов) определяют с помощью константы активирования (К_а) и ингибирования (К_i).

Известны различные низкомолекулярные соединения, которые могут снижать скорость ферментативных реакций. Такие соединения называются ингибиторами ферментов. Важно понимать, что ингибирование – это один из нормальных способов регулирования активности ферментов. Ингибирование бывает конкурентным и неконкурентным (обратимым и необратимым).

О дин из самых обычных способов регуляции метаболических путей – это регуляция с помощью аллостерических ферментов (рисунок 6.2). Аллостерическими называют ферменты, действие которых связано с изменением формы (allos – иной, другой; stereos – форма).

Рисунок 6.2 – Аллостерическое ингибирование

Особенностью любого фермента является то, что он воздействует на определенные функциональные группировки и способен на определенную химическую реакцию. При этом из массы окружающих веществ он должен выбрать одно, с которым фермент будет каким-либо образом взаимодействовать. Ферментативная реакция делится на несколько этапов (рисунок 6.3):

1. В окружающей среде фермент отыскивает нужное ему вещество.

2. Фермент присоединяет к себе найденное вещество и воздействует на него. Происходит образование комплекса фермент-субстрат.

3. Происходит отторжение в окружающую среду присоединенного вещества, но видоизмененного.

Рисунок 6.3 – Схема ферментативной реакции

В 1959 г. Кошланд предложил новую гипотезу, получившую название гипотеза «индуцированного соответствия». На основе имеющихся данных, он заключил, что субстрат, соединяясь с ферментом, вызывает какие-то изменения в структуре его активного центра. Аминокислотные остатки, составляющие активный центр фермента, принимают определенную форму, которая дает возможность ферменту наиболее эффективным образом выполнять свою функцию. Подходящей аналогией в этом случае может служить перчатка, которая при надевании на руку соответствующим образом изменяет свою форму.

Активность фермента зависит от природы и концентрации фермента и субстрата, межсубъединичных взаимодействий белковых глобул (для ферментов с четвертичной структурой), состава раствора, природы растворителя, ионной силы раствора, рН среды, присутствия ингибиторов и активаторов, температуры, давления, УФ-облучения, рентгеновского излучения и др.

Активность ферментов выражают в стандартных единицах Е, которые соответствуют количеству фермента, катализирующего превращение субстрата со скоростью 1 мкмоль в 1 мин при стандартных условиях. Более новая единица – катал (кат), соответствующая количеству фермента, катализирующего превращение субстрата со скоростью 1 моль в 1 с (1 кат = 6∙10⁷ Е).