3.3 Реакция с нингидрином
Нингидрин – специфический реактив на α-аминокислоты. Реакция с нингидрином зависит от рН среды. При рН меньше 5 образуются аммиак, диоксид углерода и альдегид. По количеству выделившегося СО2 определяют содержание аминокислот.
При рН больше 5 реакция протекает с образованием соединения сине-фиолетового цвета, которое дают все аминокислоты, за исключением пролина и оксипролина, которые образуют с нингидрином продукты желтого цвета.
Реакция идет в две стадии. На первой стадии аминокислота реагирует с нингидрином с образованием восстановленной формы нингидрина (дикетооксигидриндена), аммиака, оксида углерода и альдегида.
О
О
R
ОН ׀ СН – СООН + ОН → Н +
׀
NН2 О О
α- аминокислота нингидрин нингидрин
(восстановленный) ( окисленный )
О
׀׀
+ NН3 + СО2 + R - С – Н
альдегид
На второй стадии образовавшиеся восстановленная форма нингидрина и аммиак реагируют со второй молекулой нингидрина с образованием пурпурного пигмента, окрашенного в интенсивный сине-фиолетовый цвет и имеющего следующее строение :
ОН О
Н
N ׀
О О
Реактивы: 0,1% раствор нингидрина.
Проведение испытания: в пробирку вносят 2 см3 раствора белка, добавляют 0,5 см3 0,1% раствора нингидрина и нагревают. Смесь окрашивается в фиолетовый или фиолетово-розовый цвет, через некоторое время смесь синеет.
3.4 Реакция Миллона
При помощи этой реакции определяют наличие в белке фенольной группы тирозина. Фенолы и их производные при нагревании со специально приготовленным раствором ртути в азотной кислоте (реактив Миллона) образуют ртутные соединения красного цвета.
В
заимодействие
тирозина с реактивом Миллона идет по
реакции: Н2С
- СН - СООН Н2С
- СН - СООН
NН2 NН2
+ НNО3 +НgNО2 → + 2Н2О
О2N N О
ОН О ОНg
ртутная соль динитротирозина
Реактивы: реактив Миллона.
Проведение испытания: в пробирку вносят 2 см3водного раствора белка, прибавляют 2-3 капли реактива Миллона и нагревают на водяной бане. Появляется осадок свернувшегося белка красного цвета.
При добавлении реактива Миллона в избытке наблюдается желтое окрашивание вследствие взаимодействия белка с азотной кислотой, дающей ксантопротеиновую реакцию, которая маскирует реакцию Миллона.