11.8. Активація скорочення у гладеньких м'язах

У ланцюгу подій, що ведуть до активації скорочення в поперечносмугастих і гладеньких м'язах, спільним є лише те, що в обох випадках обов'язковою умовою для активації є збільшення концентрації іонізованого кальцію в міоплазмі. Це було переконливо доведено в дослідженнях на скінованих сапоніном м'язових клітинах. Виявилось, що пороговою концентрацією іонів Са²⁺, необхідною для активації скорочення, є 10^-7 моль/л. Максимальне скорочення спостерігається за концентрації іонів Са²⁺ 10^-5 моль/л.

Структурна основа спряження збудження–скорочення у гладеньком'язових клітинах суттєво відрізняється від такої в поперечносмугастих м'язах. Перш за все, в перших майже повністю відсутня Т-система, а саркоплазматичний ретикулум становить тільки 2–7% об'єму цитоплазми. Деякі дослідники бачать у цьому прямий зв'язок між ступенем розвитку саркоплазматичного ретикулума і здатністю гладеньких м'язів скорочуватись у безкальцієвому розчині. Здатність саркоплазматичного ретикулума гладеньких м'язів акумулювати двовалентні катіони є важливим доказом того, що, як і у скелетних м'язах, він є запасником внутрішньоклітинних іонів Са²⁺.

Скоротливий апарат гладеньких м'язів. Товсті протофібрили гладеньких м'язів складаються із міозинових молекул. Морфологічно міозинові протофібрили гладеньких м'язів відрізняються від таких самих поперечносмугастих м'язів. Вважається, що в міозинових протофібрилах голівки міозину розміщені спірально, як у скелетних м'язах, однак поки що чіткі докази цього відсутні. У гладеньких м'язах порядок розміщення молекул міозину у протофібрилах до кінця не з’ясовано. Товщина міозинових протофібрил становить 12–15 нм, довжина 2,2 мкм.

Хоч розміри й молекулярна маса міозинових молекул з двох типів м'язів є однаковими, існує відмінності в субодиничній будові молекул. Міозин гладеньких м'язів складається з двох важких ланцюгів (М = 200 кДа) і чотирьох легких ланцюгів (два з М = 20 кДа і два з М = 16 кДа).

Легкий ланцюг (М = 16 кДа) є аналогічним лужному легкому ланцюгу міозину поперечносмугастих м'язів, який називають суттєвим легким ланцюгом, оскільки його дисоціація спричинює втрату АТФазної активності міозином. Легкий ланцюг (Л₂₀) з М = 20 кДа є значущим для регуляції. Субодиниця Л₂₀ служить субстратом для специфічної Са²⁺-залежної кінази, яку називають кіназою легких ланцюгів міозину (КЛЛМ). КЛЛМ фосфорилює Л₂₀, а специфічна фосфатаза (Ф) дефосфорилює Л₂₀. Оскільки Л₂₀ може фосфорилюватись і дефосфорилюватись, цей ланцюг часто називають Р-легким ланцюгом. Міозин гладеньких м'язів відрізняється від міозину поперечносмугастих м'язів більшою лабільністю, амінокислотним складом, високою розчинністю, а також імунологічними властивостями. Його АТФазна активність є нижчою, ніж міозину поперечносмугастих м'язів, що корелює з повільним наростанням скорочення.

Головним компонентом тонких протофібрил є актин з М = 42 кДа. Так само, як і в поперечносмугастому м'язі, G-актин гладенького м'яза полімеризується у фібрилярний F-актин. У тонкій протофібрилі F-актин утворює спіральну структуру. Крім актину, в тонкій протофібрилі є тропоміозин, структура якого близька до структури тропоміозину поперечносмугастих м'язів. У тонкій протофібрилі гладеньких м'язів відсутній регуляторний білок тропонін. Це суттєво відрізняє спосіб регуляції скорочення–розслаблення у гладенькому м'язі порівняно з поперечносмугастим м'язом.

В останніх відношення товстих протофібрил до тонких дорівнює 1 : 2. У гладеньких м'язах це співвідношення коливається від 1 : 5 до 1 : 27. При цьому навіть у різних гладеньких м'язах однієї й тієї самої тварини вміст актину, на відміну від міозину, може варіювати.

Припускають, що актинові й міозинові протофібрили утворюють скоротливі одиниці, які простягаються на відносно невелику відстань під кутом до довгої осі м'язової клітини. Своїми кінцями міофібрили прикріплені до щільних тілець плазматичної мембрани, які є аналогами Z-дисків поперечносмугастих м'язових волокон. При ізотонічному скороченні ненавантаженого або малонавантаженого м'яза скоротливі одиниці розміщуються майже поперек довгої осі м'язової клітини.

На сьогодні є тільки якісні й непрямі дані відносно компартментизації кальцію всередині й зовні гладеньком'язових клітин. Виходячи з того, що порогова концентрація іонізованого кальцію, необхідного для активації скорочення, лежить у межах 10^-7 моль/л, у міоплазмі м'язових клітин розслабленого гладенького м'яза його концентрація має бути нижче 10^-7 моль/л. Концентрація кальцію в саркоплазматичному ретикулумі гладеньком'язових клітин невідома. Невелика частина кальцію, мабуть, адсорбована та зв'язана у внутрішньому примембранному шарі.

Зв’язок між збудженням і скороченням. Одночасна реєстрація електричної й скоротливої активності м'язових клітин вказує на тісний зв'язок між потенціалом дії та фазним скороченням (рис. 11.28, а). При частих потенціалах дії окремі фазні скорочення можуть складатися в зубчастий або злитий тетанус.

Щодо гладеньких м'язів, то поки не існує надійного й універсального методу, за допомогою якого можна було б домогтися розриву зв'язку між збудженням, тобто генерацією потенціалів дії у плазматичній мембрані, і скороченням. Дійсно, видалення іонів Са²⁺ з розчину або додавання до останнього блокатора кальцієвих каналів плазматичної мембрани пригнічує і потенціали дії, і скорочення у гладеньких м'язах. За цих умов подразненням м'язових клітин імпульсами деполяризуючого струму не вдається викликати скільки-небудь помітного скорочення. Отже, фазне скорочення, що виникає у гладеньких м'язах під час генерації потенціалів дії, активується, головним чином, тими самими іонами Са²⁺, які беруть участь у генерації потенціалів дії. Розрахунки показують, що при генерації поодинокого потенціалу дії амплітудою +50–60 мВ у гладеньком'язові клітини через потенціалкеровані кальцієві канали плазматичної мембрани, які відповідають за генерацію потенціалів дії, надходить достатня кількість іонів Са²⁺ для активації фазного скорочення.

Рис. 11.28. Зв'язок між збудженням і скороченням у гладеньких м'язах: а – потенціал дії м'язових клітин кишки 1 і сечоводу 2 супроводжується фазним скороченням м'язової смужки; б – гіперкалієвий розчин Кребса (100 ммольл KCl) викликає значну й стійку деполяризацію м'язових клітин кишки, яка супроводжується фазно-тонічним скороченням. Анелектротонічна ступінчаста реполяризація (Ан) м'язових клітин викликає відповідне зменшення тонічного скорочення.повтор у тексті Початок дії гіперкалієвого розчину помічено стрілкою

Досліди з калієвою деполяризацією гладеньких м'язів, що супроводжуються значним скороченням м'язової смужки (калієва контрактура), є зручною, хоч і досить наближеною, моделлю для дослідження природи електромеханічного зв'язку за деполяризуючої дії на м'язи нейромедіаторів і фізіологічно активних речовин. Встановлено, що при калієвій деполяризації скорочення активується позаклітинними іонами Са²⁺, що входять до м'язових клітин через потенціалкеровані кальцієві канали (рис. 11.28,б). Анелектротонічна ступінчаста реполяризація м'язових клітин постійним електричним струмом супроводжується зменшенням тонічного скорочення.повтор У даному разі розслаблення м'яза зумовлено закриванням (деактивацією) потенціалкерованих кальцієвих каналів.

Норадреналін викликає в м'язових клітинах ворітної вени значну деполяризацію, в результаті чого частішають спонтанні потенціали дії. Увесь цей комплекс електричних змін супроводжується фазно-тонічним скороченням м'язової смужки (рис. 11.29). Норадреналінове скорочення гладеньких м'язів ворітної вени складається із фазного компонента, активованого позаклітинними іонами Са²⁺, що входять у м'язові клітини через потенціалкеровані кальцієві канали, і тонічного компонента, також активованого переважно позаклітинними іонами Са²⁺, які входять у м'язові клітини через рецепторкеровані неселективні катіонні канали й уже згадані потенціалкеровані кальцієві канали. Верапаміл (10^-5 моль/л) пригнічує потенціали дії та фазний компонент норадреналінового скорочення й тільки частково зменшує тонічний компонент цього скорочення (рис. 11.29, крива 2). Водночас верапаміл повністю пригнічує калієву контрактуру (рис. 11.29, крива 3).

Рис. 11.29. Дія верапамілу (10^-5 моль/л) на електричну й скоротливу активність м'язових клітин ворітної вени: 1 – дія норадреналіну (На) в контролі; 2 – ефект На (15 хв дії верапамілу); 3 – ефект На після того, як додавали до розчину з верапамілом 100 ммоль/л КCl. Тривалість дії На і KCl помічено жирною лінією. Переривчаста лінія відмічає початкову величину мембранного потенціалу й скорочення. Ф і Т – фазний і тонічний, відповідно, компоненти норадреналінового скорочення

Загалом ланцюг подій, що розгортаються у гладеньких м'язах у відповідь на збуджуючу дію нейромедіатора або фізіологічно активної речовини, має таку послідовність: 1) активація хеморецепторів мембрани м'язової клітини нейромедіатором або фізіологічно активною речовиною; 2) відкривання рецепторкерованих неселективних катіонних або хлорних каналів, або закривання калієвих каналів мембрани; 3) деполяризація мембрани м'язових клітин; 4) відкривання потенціалкерованих кальцієвих каналів і генерація потенціалів дії; 5) збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів Са²⁺, що активують скорочення. У міоцитах деяких гладеньких м'язів подія 4 і навіть події 2 і 3 можуть бути відсутніми (тобто відсутній електромеханічний зв'язок), і тоді великого значення набуває активація хемокерованих кальцієвих каналів мембрани, які роблять свій внесок у збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонізованого кальцію (фармакомеханічне спряження).

Міра участі потенціалозалежних і рецепторкерованих кальцієвих каналів плазматичної мембрани, а також кальцієвих каналів саркоплазматичного ретикулума в активації скорочення різних гладеньких м'язів під впливом нейромедіаторів і фізіологічно активних речовин, мабуть, не є однаковою. Вона залежить від відносної густини щільності цих каналів у мембрані, концентрації медіатора або фізіологічно активної речовини й тих електрофізіологічних змін, які при цьому відбуваються в м'язових клітинах. Певний внесок в активацію скорочення під дією медіаторів й фізіологічно активних речовин можуть додавати й іони Са²⁺, що звільняються з внутрішньоклітинних депо. Але скорочення, яке викликано цими речовинами, в безкальцієвому середовищі завжди є меншим за скорочення у присутності в позаклітинному середовищі іонів Са²⁺, воно є короткочасним, а за повторної дії медіатора або фізіологічно активної речовини – вже й не виникає.

Початкове тонічне скорочення (базальний або міогений тонус) деяких гладеньких м'язів, і особливо судинних, також активується позаклітинними іонами Са²⁺. Ці іони надходять у м'язові клітини через потенціалкеровані Са²⁺-канали, що відповідають за генерацію спонтанних потенціалів дії, а також через стаціонарно відкриті потенціалкеровані й рецепторкеровані кальцієві канали. Перші формують тетанічний компонент тонусу, другі й треті – тонічний.

Нейромедіатори й фізіологічно активні речовини можуть спнричинювати зниження початкового тонусу або шляхом гіперполяризації, що веде до пригнічення спонтанних потенціалів дії й до закриття стаціонарно відкритих потенціалкерованих кальцієвих каналів, або шляхом закривання рецепторкерованих кальцієвих каналів через активацію хеморецепторів.

Механіка скорочення гладенького м'яза. Характерними рисами фазного скорочення гладеньких м'язів є великий латентний початковий його період (рис. 11.26, а) і повільна кінетика розвитку. Вважається, що в цих м'язах, як і в поперечносмугастих, скоротливі білки укладені у протофібрили. Тому за аналогією з поперечносмугастими м'язами можна чекати, що ступінь перекриття актинових і міозинових протофібрил, а відповідно, й активне напруження (скорочення) м'яза залежатимуть від його довжини. Крива напруження–довжина для гладеньких м'язів якісно є схожою на таку саму поперечносмугастих м'язів. Тому можна припустити, що скорочення гладеньких м'язів також відбувається за рахунок взаємного переміщення протофібрил.

Однак у цій гіпотезі існують і деякі складні моменти. По-перше, в поперечносмугастих м'язах кореляція між активним напруженням і ступенем перекриття протофібрил виявляється тільки на ізольованих м'язових волокнах за умови фіксації довжини саркомера. Відносно вільне розміщення протофібрил у гладеньком'язових клітинах не дозволяє дотриматися цього правила. По-друге, гладеньком'язові клітини є дуже малими, вони розміщуються у своєрідній сітці тканини й тому немає можливості підтримувати сталу довжину м'яза при його активації. По-третє, в більшості робіт, які присвячено вивченню зв'язку активне напруження – довжина, досліджувались довжини менші за L_o (довжина максимального активного напруження). Це пов'язано з тим, що за довжин більших за L_o м'яз пошкоджується.

У гладеньких м'язах робочий діапазон є довшим, ніж у поперечносмугастих м'язах. Так, якщо останні при максимальній активації вкорочуються до 0,5 L_o, м'язові смужки артерій вкорочуються до 0,3–0,4 L_o. Вісцеральні ж м'язи можуть вкорочуватись ще більше – до 0,2 L_o. Про це також свідчить майже таке саме вкорочення ізольованих поодиноких гладеньком'язових клітин. Проте робочий діапазон за довжин більших за L_o у гладеньких м'язах детально не вивчався. Річ у тім, що за таких довжин пасивне напруження є дуже значним, і це маскує активну відповідь м'язової смужки. Однак існуючі дані свідчать про те, що активне напруження за довжин більших за L_o у судинних м'язах швидко спадає. Таким чином, у цих межах довжин робочий діапазон у них менший, ніж у поперечносмугастих м'язах, які все ще виявляють активне напруження навіть аж до довжини 1,8 L_o.

У поперечносмугастих м'язах зв'язок активне напруження – довжина пояснюється в термінах структури саркомера й протофібрил. У цілому м'язі це відношення є таким самим, як і в окремому м'язовому волокні, й напруження пропорційне ступеню перекриття протофібрил. Хоч зараз є структурні докази того, що у гладеньких м'язах скоротливі білки укладені у протофібрили, проте гетерогенна морфологія й ультраструктура цих м'язів не дозволили визначити характер взаємодії між протофібрилами. Ось чому поки що неможливо пояснити зв'язок активне напруження – довжина в цих м'язах.

За довжин більших, ніж L_o, сильний вплив на активне напруження м’яза створює значний пасивний компонент напруження. Адже ізольована м'язова клітина має дуже мале пасивне напруження, й тому вона може видовжитись при натязі до трьох її довжин "у спокої". Отже, пасивне напруження створюється в основному міжклітинною сполучною тканиною, до складу якої входять в основному колаген та еластин. Таким чином, активне й пасивне напруження у гладеньких м'язах створюється двома незалежними й паралельними структурними утвореннями – м'язовими клітинами й міжклітинним сполучнотканинним матриксом. Хоч розташування протофібрил у гладеньких м'язах не є настільки упорядкованим, як у поперечносмугастих м'язах, вважають, що генерація сили в них здійснюється в поперечних містках міозинових протофібрил при взаємодії їх з відповідними ділянками актинових протофібрил.

Принаймні в якісному відношенні основні принципи механіки скорочення, розроблені для поперечносмугастих м'язів, можна застосувати й до гладеньких м'язів. Так, у всіх гладеньких м'язах швидкість вкорочення сягає максимуму за тих довжин, за яких ізометричне скорочення також є максимальним. За будь-якої довжини м'яза активне вкорочення буде тим повільнішим, чим більше навантаження діє на м'яз. Навантаження, що відповідають активному напруженню м'яза, запобігають його вкороченню, і за цих умов м'яз працює в ізометричному режимі. Зв'язок між навантаженням і швидкістю вкорочення кількісно описується гіперболічним рівнянням Хілла.

Регуляція скорочення–розслаблення гладеньких м'язів. Багато фактів регуляції скорочення–розслаблення гладеньких м'язів встановлено на таких скоротливих моделях, як актоміозин і скіновані м'язи. Актоміозин поперечносмугастих м'язів, очищений від ТН-ТМ-комплексу, завжди має високу АТФазну активність, яка не залежить від концентрації іонів Са²⁺. У натуральному неочищеному актоміозині ТН-ТМ-комплекс інгибує АТФазу. Тільки після зв'язування Са²⁺ з тропоніном це інгібування знімається припиняється. Як було зазначено раніше, це є прикладом актинзв'язаної регуляції. Очищений актоміозин гладеньких м'язів, навпаки, є неактивним і за відсутності тропоніну. Слід припустити існування якогось Са²⁺-залежного активатора для регуляції АТФазної активності. З’ясування природи такого активатора є головним питанням регуляції у гладеньких м'язах.

Зараз розглядаються дві моделі регуляції у гладеньких м'язах. Перевага віддається моделі, в якій у регуляцію втягується фосфорилювання легкої субодиниці міозину Л₂₀. Цей тип регуляції називають міозинзв'язаною регуляцією. Кіназа легких ланцюгів міозину каталізує перенесення кінцевого фосфату від АТФ на легкий ланцюг міозину Л₂₀. Процесс фосфорилювання є можливим лише тоді, коли високомолекулярна КМ з М = 125 кДа (рис. 11.30, 125К) взаємодіє з низькомолекулярним кальмодуліном з М = 17 кДа (рис. 11.30, 17К). Обидві ці субодиниці є необхідними для утворення активної КЛЛМ.

Рис. 11.30. Регуляція скорочення–розслаблення гладкого м'яза:  – адренорецептор; АЦ – аденілатциклаза; нПК і аПК – неактивна й активна форми протеінкінази; Ф – фосфатаза; КЛЛМ, нКЛЛМ – активна та неактивна форми кінази легких ланцюгів міозину, відповідно; 17К – кальмодулін; 125К – каталітична субодиниця КЛЛМ; А – актин; М – міозин; Л₂₀ – легкий ланцюг міозину; ~ – фосфорильований міозин – інтермедіантна конформація міозину, збагачена енергією

Активація КЛЛМ відбувається лише при взаємодії 125К з кальмодуліном 17К, який зв'язав іони Са²⁺ (Са²⁺ - 17К). Таким чином, збільшення концентрації іонів Са²⁺ у гладенькому м'язі служить сигналом для активації КЛЛМ. В активному стані КЛЛМ фосфорилює легкий ланцюг міозину Л₂₀ (див. рис. 11.30). Міозинова АТФаза за фізіологічних умов за допомогою актину активується лише тоді, коли Л₂₀ фосфорилюється. Активований актоміозин АМ гідролізує АТФ, унаслідок чого відбувається скорочення гладенького м'яза. Інактивація актоміозинової АТФази досягається дефосфорилюванням міозину за допомогою міозинової фосфатази.

У гладеньких м'язах важлива роль належить циклічному нуклеотиду цАМФ, збільшення концентрації якого в м'язі викликає його релаксацію. Речовини, що зумовлюють релаксацію гладеньких м'язів, взаємодіють з -адренорецепторами, що активує аденілатциклазу (АЦ) (див. рис. 11.30). У результаті збільшується кількість цАМФ, що активують протеїнкіназу. Активована протеїнкіназа фосфорилює КЛЛМ, переводячи його в неактивну форму (нКЛЛМ) і таким чином зменшуючи вірогідність фосфорилювання Л₂₀. Ці процеси інгибують активацію гладенького м'яза.

Запропоновано й іншу гіпотезу, що виключає фосфорилювання Л₂₀. За цією гіпотезою, можливою є актинзалежна регуляція скорочення. Головна роль у такій регуляції належить білку кальдесмону (КД), який виділений у невеликих кількостях з тонкої протофібрили гладеньких м'язів. Це значно витягнута (до 80 нм) й тонка білкова молекула (М ~ 95 кДа), яка складається з чотирьох доменів, які мають специфічні сайти для зв’язування з тропоміозином й актином. Стехіометрія зв’язування є такою: 1КД : 2ТМ : 14 актинових молекул. Важлива роль належить четвертому домену, який локалізується на С-кінці кальдесмону. Цей домен має специфічний сайт зв’язування кальмодуліну (К17). За участю іонів Са²⁺, які зв’язуються з К17, утворюється активний комплекс КД–К17–Са²⁺. Такий комплекс переводить актин ТМ-філамент зі стану «off» (вимкнений) у стан “on” (увімкнений), і голівки міозину можуть з’єднуватися з актином і генерувати механічну силу. Отже, в гладеньких м’язах можливі кілька шляхів регуляції – через фосфорилювання L₂₀ Л (міозинзалежна регуляція) чи за участю кальдесмону (актинзалежна регуляція). Перевага першого або другого шляху регуляції залежить від типу м’яза.