13.2. Дополнительная литература
13.2.1. Березин И. В., Савин Ю. В. Основы биохимии. – М.: Изд-во МГУ, 1990. – С. 130 – 165.
13.2.2. Методы химии углеводов. Под ред. Н. К. Кочеткова. – М.: Мир, 1967. – 512 с.
13.2.3. Методы исследования углеводов. Под ред. А. Я. Хорлина. – М.: Мир, 1975. – 444 с.
13.2.4. Чирков Ю. Г. Фотосинтез: два века спустя. – М.: Знание, 1981. – 192 с.
13.2.5. Павлов А. В. Эмбриональное развитие и гистофизиология органов у детей и подростков – http://www.yma.ac.ru/books/hist/child.htm
13.2.6. Бегун П. И., Шукейло Ю.А. Биомеханика. Учебник для ВУЗов. – СПб.: Изд-во Политехника, 2000. – 463 с.
13.2.7. Фаллер Д. М., Д. Шилдс. Молекулярная биология клетки. Руководство для врачей. – М.: Бином-Пресс, 2004. – 272 с.
13.3. Экспериментальная часть
Очевидно, что выявление и количественное определение глицидов может быть важным в экологических и отраслевых изысканиях, связанных с лесоводством, сельским хозяйством и пищевой промышленностью, а самая популярная даже в быту – качественная реакция на запасные гликаны с йодом. К сожалению, механизм ее развития до конца не понят, но с большой долей вероятности его объясняют сорбцией атомов иода между остатками моноз. Из качественных реакций на монозы и дисахара, вспомним про образование окрашенных продуктов конденсации – фурфурола и озазонов, а также реакции серебряного и медного «зеркала», Троммера, с фелинговой жидкостью, реактивом Бенедикта и т.п. Т.к. они рассмотрены в курсе органической химии и, частью, в занятии 11.3.3, добавим лишь, что фильтровальная бумага, пропитанная подобными реактивами, служит основой редуктометрических тест-полосок для экспресс-анализа глюкозы в биожидкостях.
Для нужд физиологии, ветеринарии и медицины исключительно важно количественное определение глюкозы, как основной монозы плазмы животных и интегрального показателя углеводного гомеостаза. В норме, независимо от пола, её концентрация у взрослых людей составляет 4,16 – 5,27 ммоль/л. Но, в зависимости от метода исследований, на результат могут влиять: 1) способ удаления из крови, мешающих определению белков и клеток и 2) степень специфичности и чувствительности качественной реакции, примененной в фотометрии. Поэтому в лабораторной практике, с учетом способа определения, нормальными считаются вариации уровня глюкозы от 2,50 до 6,38 ммоль/л. Так, ряд лабораторий до сих пор применяет в этих целях относительно простой и надежный ортотолуидиновый способ, сохраняющий обычные недостатки колориметрических методик. Но альтернативой ему, все чаще служат высокоспецифичные энзиматические методы, с разной степенью их автоматизации и экспрессности.
13.3.1. Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в био-жидкостях с помощью тест-наборов фирмы Lachema (Чехия)
Он возможен без осаждения белков плазмы, но при определении глюкозы в цельной крови, плазме и сыворотке с признаками гемолиза, липемии и желтухе = иктерии, субстраты предварительно депротеинизируют. Поэтому целесообразно привести более полный вариант анализа.
Принцип метода: Белки проб осаждают депротеинизирующим раствором, содержащим уранилацетат, токсичный, как все соли тя-желых металлов! ВНИМАНИЕ!!! При попадании раствора внутрь, немедленно выпить 0,5 л воды и вызвать рвоту, а затем действовать по пункту 1.1.31. В соответствии со схемой (рис. 13.3), ФАД-зависимый Е микробного происхождения глюкозооксидаза в роли биосенсора, специфично окисляет глюкозу в безбелковом надосадке, а затем регенерирует ФАДН2 с помощью кислорода атмосферы. Т.к. сходство структуры и свойств глюкозы и глюконовой кислоты затрудняют их различение, обычно определяют эквимолярную концентрацию пероксида водорода. В данном методе это делают с помощью сопряженной пероксидазной реакции азосочетания, после чего, против воды и стандарта = эталонного раствора глюкозы, фотометрируют интенсивность окраски продукта.
Рис. 13.3. Схема ферментного анализа количества глюкозы
Ход работы: 1. В маркированную центрифужную пробирку внести 0,5 мл раствора 2 (смесь 0,02 М уранилацетата в 0,82 М хлориде натрия).
2. В соответствии с п. 3.3.1, с помощью полуавтоматического дозатора добавить в пробирку 50 мкл цельной крови с антикоагулянтом, перемешать и оставить в штативе на 10 мин.
3. Согласно п. 6.3.1., попарно уравновесить пробирки на центрифужных весах и разместить их в гнездах по диаметру ротора центрифуги.
4. Убедившись, что все студенты выполнили пп. 1-3, дежурный закрывает центрифугу крышкой и, соблюдая п. 1.1.20, включает ее при 1500 об/мин на 15 мин.
5. Во время центрифугирования, в 2 пробирки внести по 0,5 мл раствора уранилацетата и, меняя наконечники, добавить дозатором в контроль – 50 мкл дистиллята, а в эталон – 50 мкл раствора 1 (стандарт глюкозы с концентрацией 10 ммоль/л).
6. После центрифугирования, из пробирок, меняя наконечник дозатора, соответственно таблице в 3 маркированных пробирки вносят:
7. Пробы перемешать и поместить в термостат при 37 С на 30 мин.
8. За 10 мин до окончания инкубации, в соответствии с работой 4.3.1, включить для прогрева ФЭК КФК-2,
9. Фотометрировать пробы 2 и 3 против контроля, при λ = 480 нм в кюветах толщиной 5 мм. Результаты измерений абсорбции = А занести в протокол опыта.
10. В соответствии с формулой: Глюкоза, ммоль/л = 10 х А2/А3, где: А2 – абсорбция пробы и А3 – эталона, рассчитать ее концентрацию в крови и сделать выводы из работы.