Занятие 4. Методы спектроскопии в анализе биомолекул и клеток

4.1. Основы спектроскопии. Известно, что видимый свет, лишь малая часть спектра электромагнитных излучений, чьи взаимно перпендикулярные электрическая и магнитная компоненты, периодически меняются местами. Поэтому энергию кванта (ε), частоту (ν) и длину их волн (λ) объединяют жесткие зависимости (рис. 4.1). В соответствии с ними, электромагнитный спектр условно делят на частично перекрывающиеся диапазоны, отчасти зависящие от источника излучений. Так, нет принципиальной разницы между волнами одной и той же длины в ИК и микроволновом диапазонах. Но, их называют ИК-лучам при генерации тепловым прибором и относят к микроволнам, если он электронный.

Рис. 4.1. Схема шкал электромагнитного спектра

Из блок-схемы (рис. 4.2) видно, что независимо от диапазона, все спектрометры включают, т. н. оптопару: 1. источник монохромного излучения энергии с длиной волны X и 2. его приемник = детектор, преобразующий сигнал в электроток индикатора.

Рис. 4.2. Принципиальная схема однолучевых спектрометров

Третью составляющую – кювету с изучаемым образцом (3) размещают между ними, сопоставляя потоки энергии излучателя Ф_о и детектора Ф₁, для получения информации о структуре и свойствах объекта исследований. Так удалось выделить 2 класса спектров: эмиссии = испускания и абсорбции = поглощения. Известно, что по закону Г. Кирхгофа (1859) – любое вещество хорошо поглощает излучения именно тех λ, которые само испускает. В свою очередь, каждый класс излучений подразделяют на непрерывные = сплошные, полосатые и линейчатые спектры.

Эмпирические данные И. Ньютон (1666), Й. Фраунгофер (1814) и др. и закон взаимосвязи спектров поглощения и испускания, позволили Г. Кирхгофу и Р.Бунзену открыть важнейший закон физической оптики: каждый атом (функциональная группа, молекула, кристалл) испускает характерный линейчатый спектр электромагнитных волн. На этой основе была создана теория характеристических спектров, позволившая открыть He, Rb, и др. химические элементы, а в ХХ в. – сделать приборы и методы спектрального анализа универсальным инструментом изучения законов существования Вселенной (табл. 4.1).

Таблица 4.1

Характеристика основных диапазонов электромагнитного спектра

Продолжение таблицы 4.1

Применительно к химии и биологии важно, что энергия квантов излучений с λ < 1 нм, разрушает атомные ядра и химические связи, тогда как у волн длиной > 1000 нм, недостаточно энергии для изменений молекулярной структуры вещества. Поэтому основой идентификации веществ стали ИК и, реже УФ диапазоны. А в основу фоторецепции клеток и организмов, лег эволюционный отбор молекул красящих и зрительных фотопигментов, способных при поглощении квантов излучений промежуточной области, максимально изменять орбитали электронов, участвующих в образовании сопряженных двойных связей.

Как сказано выше, понятие свет относят к области электромагнитных волн в диапазоне 10^-8-10^-6 м (рис. 4.3). Человек и другие

млекопитающие видят лишь в небольшой части спектра, соответственно длинам волн 380 – 800 нм. Но, люди с удаленным хруcталиком, воспринимают УФ-диапазон, как и насекомые, которых привлекают, невзрачные для млекопитающих цветы. При том известно, что птицы – не видят в синей области спектра, ряд пресмыкающихся воспринимает ИК лучи, а летучие мыши и дельфины пользуются ультразвуковой эхолокацией.

Рис. 4.3. Видимая область спектра для млекопитающих

Фотометрический анализ – совокупность методов качественного и количественного анализа по интенсивности УФ, видимого и ИК излучений. Но, т.к. биообъекты на 2/3 состоят из воды, высокая теплоемкость которой поглощает ИК лучи, то в биологии их почти не применяют, широко используя 2 других диапазона (рис. 4.4).

Рис. 4.4. Схема методов фотометрии ( по http://www.krugosvet.ru/ articles/ 23/ 1002315/1002315a1.htm)

Нередко фотометрию сводят к молекулярно-абсорбционному анализу, основанному на объединенном законе светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера. Согласно ему, в стандартных условиях кюветного отделения и длины волны, перпендикулярной толщине слоя однородной среды (l), между концентрацией (С) поглощающего вещества и соотношением интенсивностей исходного = Ф₀ и достигшего детектора = Ф₁ потоков излучений, возникает логарифмическая зависимость: С = lg Ф₀/Ф₁. Отсюда появился не очень точный, но распространенный синоним – концентрационный анализ.

При стандартных λ и толщине образца, количество света достигшее фотодетектора выражают линейной шкалой светопропускания = Т (transition), которую для удобства в работе, обычно градуируют в %. К сожалению, она не имеет прямого отношения к свойствам образца, ослабляющего интенсивность излучений за счет поглощения = А (absorbtion) или, таких устаревших понятий, как оптическая плотность = D (density) раствора и коэффициент его экстинкции = Е. С другой стороны, зависимость 2 – lg T = А, обеспечивает высокую точность измерения концентраций в диапазоне 0,2-0,8 безразмерной логарифмической шкалы от 0 до ∞.

Во избежание оптических эффектов, способных исказить результаты, фотометрию проводят в закрытых кюветных отделениях фотометров, а хрупкие кюветы с плоскопараллельными стенкам – берегут от падений, царапин, потеков и капель. По той же причине, нельзя касаться руками оптических стенок кювет, а после употребления – их тщательно моют с мылом и хранят в дистилляте, высушив перед следующим измерением. Чтоб кюветы не запотевали, их заполняют растворами комнатной температуры до уровня, при котором поток света целиком проходит через раствор.

Таблица 4.2

Сравнительная характеристика фотометров

В таблице 4.2 представлены важнейшие эксплуатационные характеристики однолучевых фотометров, предназначенных для измерений в УФ и видимой областях спектра. Так как у колориметров они гораздо проще, то и стоимость их ниже, примерно на порядок. Спектрофотометрия в УФ диапазоне позволяет: 1) идентифицировать вещества по их характерным спектрам поглощения; 2) при стандартной длине УФ лучей измерять в 1 М водных растворах многих веществ, их важнейшую спектральную характеристику – молярный коэффициент абсорбции (табл. 4.3). Этот неразрушающий метод позволяет экономить препарат, сводя измерение концентраций к замеру спектральных максимумов поглощения биомолекул. Аналогично, рутинные измерения активности ферментов упрощают до т.н. теста Варбурга, определяя в стандартных условиях, прирост или убыль 1 мкмоль НАДН (НАДФН).

Таблица 4.3

Расчет концентраций биомолекул по их спектральным

характеристикам УФО

Так как большинство веществ поглощает видимый свет незначительно, то окрашенные продукты, в количестве, пропорциональном концентрации исходного вещества, получают из них после определенных физико-химических воздействий, включая качественные реакции. Этот прием широко применяют для колориметрии в относительно простых фотоэлектроколориметрах = ФЭКах. Из биомолекул, так определяют концентрации ортофосфата = неорганический фосфат (Фн) и других фосфоорганических соединений, железа, мочевины, билирубина, холестерола, жирных кислот, белка, гемоглобина и др. До недавних пор, мирясь с недостатками, так же определяли глюкозу, фруктозу, крахмал, гликоген и др. сахара, пока колориметрию углеводов не вытеснили ферментные и электрометрические метода анализа.

При колориметрии, изучаемый раствор сравнивают с поглощением: 1. контрольного образца и 2. проб стандартного ряда = шкалы сравнений или графика калибровки. В качестве контроля обычно используют растворитель или раствор со всеми компонентами, кроме исследуемого вещества. Напротив, чтобы концентрация анализируемого вещества пропорционально убывала в 3 – 5 параллельных пробах шкалы сравнений, ее готовят разведением раствора точной концентрации, с учетом чувствительности конкретного метода, температуры среды и времени развития окраски. Результаты колориметрии проб шкалы сравнений оформляют в виде графика зависимости интенсивности окраски (ось ординат) от концентрации анализируемого вещества (ось абсцисс), добиваясь его прямолинейности. За редкими исключениями, полученный график нельзя экстраполировать за пределы экспериментальных точек. Оптимизируя размер кювет нужно стремиться, чтобы значения А калибровочного графика уложились в интервале 0,1 – 1,0, а еще лучше – 0,1 – 0,6.

Так как все ФЭКи различаются степенью монохроматизации света и, соответственно, чувствительностью, недопустимо пользоваться калибровочным графиком или таблицей соотношений А и С, построенными для других ФЭКов! Больше того, калибровки, построенные с реактивами разных партий, как правило, не совпадают. Поэтому при смене реактивов, график приходится строить заново. После измерений абсорбции в опытных пробах, концентрации анализируемого вещества в них определяют в соответствии с калибровочным графиком или таблицей, с учетом объема исследуемого раствора. Если величина А пробы окажется выше имеющихся значений графика (таблицы), во избежание искажения результатов, разбавлять реакционную смесь для повторной колориметрии не рекомендуется. В этих случаях, лучше повторить колориметрический тест с меньшим объемом исследуемого материала, чтоб его результаты попали на калибровку.