Жидкостная хроматография и с чем её едят.

Итак, здесь можно провести много параллелей с газовой хроматографией. Так, например, сохраняются такие узлы, как термостат, контроллер, устройство ввода пробы (только здесь это дозирующая петля или автосамплер, которыми, кстати, также и ГХ оснащаются), детектор. Но здесь уже нет газа-носителя, здесь есть подвижная фаза, жидкость, которая качается насосами. Да и термостаты здесь не греют до 400 градусов. Средняя температура для ВЭЖХ, СВЭЖХ – до 50 градусов.

Ну а теперь вернемся к сути этого метода.

Как и в любом аналитическом методе, в хроматографии легко прослеживаются «волны», когда тот или иной вид детектирования или разделения становился популярным. Так, например, можно отметить популярность электрохимических детекторов в 70-80 годы, диодно-матричные и ELSD детекторы в период с 1990 по 2000 год, а на сегодняшний день популярным стал вариант хромато-масс-спектрометрии. При этом уже стали классическими такие детекторы, как спектрофотометрический (и его более продвинутая версия – диодно-матричный, позволяющий за одно измерение снять весь спектр), рефрактометрический и флуориметрический.

Конечно, масс-спектрометрический детектор используется в хроматографии уже давно. Более того, масс-спектрометрия вполне может существовать как отдельный, независимый метод, используемый для идентификации веществ по фрагментарным ионам, но именно сочетание хроматографии и масс-спектрометрии позволяет проводить наиболее сложные исследования практически для любых объектов (начиная от метаболомики и до петролеомики).

Но об этом позже. Поговорим о более традиционных детекторах:

– диодно-матричный детектор (рис. 3)

На рис. 1 представлена принципиальная схема диодно-матричного детектора. В качестве источника излучения могут выступать дейтериевая и вольфрамовая лампы. Каждая из них используется для снятия своей области спектра. Так, дейтериевая лампа позволяет работает в УФ-области, а вольфрамовая – в видимой. В зависимости от конструкции детектора, он может работать как в UV-VIS, так и только UV. Помимо наличия лампы, необходимо учитывать наличие диодов, регистрирующих данную область спектра. Именно эти диоды и обуславливают основное преимущество диодно-матричного детектора перед спектрофотометрическим, который позволяет снимать только на 5 предварительно заданных длинах волн.

Минимальная ширина оптической щели для этого типа детекторов – 1.2 нм.

Рисунок 3 – принципиальная схема диодно-матричного детектора

Несмотря на все очевидные преимущества данного детектора (возможность получения всего спектра в ходе одного измерения, простота применения, распространенность, относительно невысокая стоимость) существует также и ряд недостатков:

– сравнительно невысокая чувствительность;

– необходимость тщательного подбора компонентов подвижной фазы (требование к УФ-прозрачности растворителей);

– для проведения качественного анализа в любом случае необходимо использование стандартных образцов;

– низкая селективность.

Другим интересным детектором в ВЭЖХ является ELSD.

Поток жидкости попадает в капилляр, после чего распыляется большим потоком инертного газа (азота). В камере испарения растворитель испаряется, а поток частиц нелетучих анализируемых веществ рассеивает свет лазерного луча в камере светорассеяния, в которой имеется стеклянный стержень, расположенный перпендикулярно лучу лазера на расстоянии 2–5 мм от него. Стержень служит в качестве коллектора рассеянного света. Через стержень часть рассеянного света попадает на фотоумножитель. Показания детектора пропорциональны массовой скорости потока вещества, что особенно важно при его использовании с колонками малого диаметра.

Однако вернемся к самому методу жидкостной хроматографии, ведь развивались не только способы детектирования, но и способы разделения.

Так, на сегодняшний день все большую популярность набирают UHPLC-системы (Ultra High Performance Liquid Chromatography, СВЭЖХ, УВЭЖХ). Принцип действия этих систем остался таким же, как и у обычных ВЭЖХ-систем, что вполне логично и очевидно. Так что же изменилось? В первую очередь – рабочие давления. Так, СВЭЖХ-системы работают при давлении до 103 МПа (в то время как обычные ВЭЖХ-системы работают в пределах 20-40 МПа). Причиной тому стало появление нового поколения колонок для жидкостной хроматографии, имеющих зернение сорбента от 1.3 мкм до 3 мкм. Так, колонка 75 х 2 мм (длина и внутренний диаметр) и сорбентом 1.7 мкм эквивалентна колонке 250 х 2, 5 мкм, а в ряде случаев она даже способна обеспечивать большую эффективность и более низкие пределы детектирования. И если с эффективностью все более-менее понятно, то за счет чего же достигаются низкие пределы детектирования? Дело в том, что ширина пиков в ВЭЖХ всегда была достаточно большой (в среднем 0,3-0,5 мин), в то время как в СВЭЖХ ширина пика может быть всего 0,1-0,2 мин при прочих равных.

Но все ли так хорошо? Отнюдь. Всегда есть подводные камни. И СВЭЖХ – не исключение. Дело в том, что добиться однородности сорбента при таком зернении – практически нереально. Именно поэтому фирмы идут на различные ухищрения. Обратите внимание на рисунок 4:

Рисунок 4 – Core-shell технология изготовления сорбента (Phenomenex)

В основу сорбента кладется не классический силикагель, а полимерное ядро, на поверхность которого и прививаются силанольные группы, которые впоследствии модифицируются (в зависимости от задач) (рис. 5).

Рисунок 5 – наиболее распространенные типы сорбентов в ВЭЖХ на примере колонок Phenomenex.

Однако эта полимерная основа может «закупорить» колонку (за счет расширения основы), если использовать 100% водный или органический элюент (состав элюента, приводящего к таким последствиям может отличаться из-за разных материалов основы). При этом восстановить, регенерировать колонку не представляется возможным. Таким образом, при работе с этими колонками всегда стоит внимательно изучить граничные условия их применимости.

В таблице 2 представлены основные типы неподвижных фаз, используемых в ВЭЖХ:

Таблица 2 – наиболее распространенные типы НФ в ВЭЖХ.

Неподвижная фаза	Аналиты
XB-C18 (С18 с бутильными боковыми цепями от Si)	Неполярные соединения
PFP (пентафторфенил)	Полярные и ароматические соединения
HILIC (SiOH)	Полярные соединения
C18	Неполярные соединения
C8	Неполярные соединения, наиболее распространенная колонка в USP.
Phenyl-hexyl	Ароматика, идеально для ароматических УВ.

Другой интересной разновидностью являются монолитные колонки. В монолитных колонках сорбционный слой представляет собой единый жесткий пористый стержень. В качестве полимерных материалов были использованы сополимер стирола с дивинилбензолом, полимеры на основе акрилатов, метакрилатов, глицидилметакрилата, этилендиметакрилата и др.

Получены монолитные колонки большого диаметра (более 5 см), предназначенные для препаративных разделений, микронасадочные, капиллярные и наноколонки на основе чипа. Огромным плюсом этих колонок является низкое рабочее давление при достаточно высоких скоростях потока, что позволяет достигнуть достаточно высокой эффективности разделения за счет увеличения массопереноса.

Отдельной областью жидкостной хроматографии является хиральная ВЭЖХ, основной задачей которой является разделение оптических изомеров, однако этот вид известен уже давно, поэтому мы не будем подробно останавливаться на нем.

Нельзя не отметить и некоторые специфические варианты жидкостной хроматографии. Одним из таких вариантов является центрифужная хроматография (разделение на спиральных вращающихся колонках). Этот вариант реализуется следующим образом: колонка с неподвижной ЖИДКОЙ фазой наматывается на планетарную центрифугу и включается. Одновременно включается насос, который качает подвижную фазу через колонку. За счет центробежной силы фаза практически стационарна. Данный вариант использовался в МГУ для реализации ионообменной хроматографии Б. Я. Спиваковым.