Лабораторная работа № 4

«Микробиологические методы определения антибиотической активности»

Занятие № 8

Тема занятия: Определение концентрации антибиотика методом серийных разведений

Цель работы: на основе знаний методологии проведения микробиологического контроля активности антибиотиков методом серийных разведений научиться применять его на практике и рассчитывать содержание антибиотиков в растворе, биологических жидкостях и тканях.

Задачи обучения:

• освоение правил работы в лаборатории с биообъектами;

• проведение оценки активности антибиотиков в растворе:

• проводить определение мутности с использованием стандартов мутности;

• построение графической зависимости дозы антибиотика от величины диаметра зоны задержки роста тест-микроба для стандартных и опытных растворов антибиотиков;

• использование графической зависимости и стандартной таблицы для расчета активности (концентрации) антибиотиков.

ЗАДАНИЕ 1. Подобрать наиболее рациональные составы питательных сред для различных групп микроорганизмов.

ЗАДАНИЕ 2. Правильно рассчитать количественный состав по предложенной прописи и приготовить плотную питательную среду в чашке Петри, а также в пробирке со скошенной средой.

Материальное обеспечение работы

• пробирки стерильные объемом 20 мл;

• чашки Петри стерильные;

• пипетки стеклянные объемом от 1 до 10 мл;

• стерильные цилиндры из алюминия или нержавеющей стали;

• пинцет стерильный;

• суспензия тест-микроба;

• стандарт антибиотика;

• агаризованная питательная среда;

• стандарты мутности;

• стерильный физиологический раствор.

• термостат;

• ламинарный шкаф;

• водяная баня или СВЧ-печь для расправления агаризованной питательной среды;

• весы аналитические;

• столик с уровнем.

Метод серийных разведений

Принцип метода заключается во внесении одинаковой дозы испытуемых микроорганизмов (или тест-микроба) в питательной среды с различной концентрацией антимикробных (или исследуемых) веществ с последующим определением минимальной подавляющей концентрации (при изучении антибиотикочувствительности), мутности или изменения окраски культуральной жидкости по сравнению со стандартным препаратом (при определении концентрации антибиотика).

Питательную среду (обычно это среда Гисса с глюкозой и реактивом Андрее или фенолсывороточная среда) заражают стандартной взвесью определенного для каждого антибиотика тест-микроба из расчета 10 000 микробных клеток на 1 мл среды. Зараженную среду разливают по 0,2 или 0,5 мл в стерильные пробирки. Для каждого образца готовят 2 ряда по 10 пробирок в каждом. Первый ряд служит для разведения раствора стандартного антибиотика, второй – для разведения испытуемого материала. Разведения (двукратные, последовательные) испытуемого раствора и стандартного образца производят в объеме 0,2 или 0,5 мл засеянной среды. Контролем опыта служат незараженная (контроль прозрачности и стерильности) и зараженная соответствующим тест-микробом (контроль роста культуры) среды. Результат учитывают после 16-18 ч инкубации при 37 ºС и оценивают его по изменению цвета (среда Гисса становится розовой, фенолсывороточная – из красной при рН=7,2 становится желтой в результате сбраживания микроорганизмами глюкозы и изменения рН) и помутнению среды (нефелометрически).

Для установления концентрации антибиотика в исследуемом образце умножают наибольшее разведение раствора исследуемого образца, задерживающее рост тест-микроба (разведение в последней пробирке с прозрачной, не изменившей цвет средой), на наименьшую концентрацию стандарта антибиотика в пробирке с отсутствием роста. Полученная величина соответствует содержанию антибиотика в 1 мл исследуемого образца.

В приведенном табл. 1 примере стандарт пенициллина задерживает рост тест-микроба при концентрации антибиотика, равной 0,025 ЕД/мл, а испытуемая сыворотка – в разведении 1:8. Содержания пенициллина в разведенной сыворотке соответствует 0,025×8=0,2 ЕД/мл.

Таблица 1. Определение содержания пенициллина в сыворотке

Разведение сыворотки	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64
Рост тест-микроба	-	-	-	+	+	+
Концентрация стандарта пенициллина в среде, ЕД/мл	0,2	0,1	0,05	0,025	0,0125	0,0063
Рост тест-микроба	-	-	-	-	+	+

Примечание: (+) – рост тест-микроба, (-) – отсутствие роста.