Побудова калібрувальної кривої.
Для розрахунку активності необхідно побудувати калібрувальну криву по тирозину і обчислити за нею тирозиновий еквівалент, тобто ту оптичну густину, яку дав би 1 мкМ тирозину в 1 мл. Тирозиновий еквівалент використовується для обчислення протеолітичної активності.
Для побудови калібрувальної кривої готують розчин тирозину з концентрацією 10-3 М. Для цього наважку 182,19 мг чистого тирозину розчиняють в 1 л 0,2 н. HCl. Із цього вихідного розчину готують подальші розведення, при цьому беруть 1, 2, 3, 4, 5 мл вихідного розчину у мірну колбочку місткістю 50 мл і доводять до мітки 0,2 н. HCl. Тоді виготовлені розчини будуть мати відповідно 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 мкМ тирозину в 1 мл.
Потім у пробірку вносять по 1 мл стандартних розчинів, додають при перемішуванні по 5 мл 0,5 М Na2CO3 і 1 мл робочого розчину Фоліна. Глухий дослід готують так само, але замість розчину тирозину беруть 1 мл дистильованої води. Через 20 хв після додавання реактивів інтенсивність утвореного забарвлення вимірюють на фотоелектроколориметрі. Вимірювання проводять проти глухого досліду з червоним світлофільтром у кюветах з завтовшки 10 мм. Для більшої точності рекомендується приготувати три наважки тирозину і провести описаним вище методом три паралельних досліди. За одержаними даними будують калібрувальний графік, відкладаючи на осі абсцис кількість тирозину, а на осі ординат – відповідні значення оптичної густини.
На основі калібрувального графіка виводять тирозиновий еквівалент (ТЕ). ТЕ – оптична густина розчину тирозину, який містить 1 мкМ тирозину в 1 мл. На наведеній кривій 0,1 мкМ тирозину дає оптичну густину 0,151, тоді 1 мкМ повинен дати 1,51. Значить ТЕ дорівнює 1,51.
Розрахунок активності. Протеолітичну активність од/г, визначають за формулою
ПС=
,
од/г
де D=D0 –DK – оптична густина; 4 – об’єм реакційної суміші, мл; 10 - час гідролізу, хв; n – кількість ферментного препарату, яку взято на протеоліз, мг у 1 мл ферментного розчину; 1000 – переведення одержаних одиниць на 1 г ферментного препарату.
Для визначення протеолітичної активності розчину (наприклад, культуральної рідини), од/мл, користуються формулою,
ПС =
де n - кількість розчину, взятого на аналіз, мл; Р – розведення досліджуваного розчину.
Реактиви:
Розчин субстрату – 2 %-й розчин казеїну. Для його приготування 2,0 г повітряно-сухого казеїну (вологість 8–10 %) заливають 100 мл 1/15 М фосфатного буферу рН 8,0 і нагрівають до повного розчинення осаду на водяній бані, перемішуючи скляною паличкою. Після охолодження розчину перевіряють рН потенціометрично і у разі необхідності доводять до значення 8,0 додаванням 1 н NaOH або 1 н HCl. Розчин можна зберігати у холодильнику не більше трьох діб .
2 %-й розчин гемоглобіну (субстрат). Для його приготування наважку 2 г повітряно-сухого гемоглобіну розтирають у ступці з невеликою кількістю дистильованої води, переносять кількісно у мірну колбу на 100 мл, підкислюють 0,3 н HCl до рН 3,0 і об’єм доводять до мітки дистильованою водою. Розчин необхідно готовити щодня, бо він нестійкий.
0,3 М розчин трихлороцтової кислоти. Для його приготування беруть наважку 50 г ТХО беруть на технічних терезах, переносять у колбу на 1 л і доводять до мітки дистильованою водою, після чого фільтрують.
Визначення активності лужної протеази ( метод ФОЛП)
Метод розроблено на основі методу Ансона спеціально для визначення активності лужних протеаз.
За одиницю протеолітичної активності взято таку кількість ферменту, яка каталізує гідроліз 1 г білка (казеїну) в строго визначених умовах – рН 10,5 і при температурі 40 оС, тривалість гідролізу 1 год.
Метод базується на визначенні тирозину, що утворюється в результаті гідролізу білка, з реактивом Фоліна, як і метод Ансона.