Лабораторная работа № 5. Обнаружение, идентификация и определение остаточных количеств левомицетина в продуктах животного происхождения хроматографическим методом анализа

Общие сведения: Среди ряда посторонних веществ, которые могут загрязнять различные пищевые продукты, важное место занимают лекарственные средства, в частности антибиотики, широко применяемые в ветеринарии и животноводстве, что предопределяет необходимость проведения соответствующих мероприятий для снижения уровня загрязненности продуктов этими веществами, а также организации контроля за остаточными количествами препаратов в продуктах животного происхождения.

При систематическом поступлении в организм человека с пищей антибиотики могут вызывать различные аллергические реакции, нарушение обмена веществ, дисбактериоз, изменять микрофлору и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов по переработке мяса, рыбы, молока и др. продуктов.

Левомицетин (хлормицетин, хлорамфеникол) – эффективный синтетический антибиотик широкого спектра действия, запрещен к использованию в ветеринарии и животноводстве для лечения скота и птицы, мясо, молоко и яйца которых предназначены для питания людей, что связано с высокой токсичностью левомицетина. Однако относительная дешевизна этого препарата и высокая антибактериальная активность приводят к нелегальному использованию его в относительно высоких масштабах.

Как правило, для контроля уровней содержания антибиотиков в том числе, левомицетина, используют микробиологические методы определения. Однако вследствие недостаточной чувствительности и эффективности этих методов, а также их большой трудоемкости и длительности проведения анализов в настоящее время наиболее часто применяют химические методы определения антибиотиков в пищевых продуктах с использованием хроматографического разделения.

Сущность метода: Контроль остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах проводится с помощью простого химического метода анализа, основанного на извлечении антибиотика экстракцией органическим растворителем, концентрировании экстракта, отделении левомицетина в тонком слое силикагеля от коэкстрактивных веществ и определении его после восстановления в виде производного с n-диметиламинобензальдегидом. Этот метод рекомендован для серийных анализов пищевых продуктов в условиях санэпидстанций, заводских и сельскохозяйственных лабораторий. Предел обнаружения левомицетина на хроматографической пластинке 5-10 нг в зоне. Относительное стандартное отклонение при визуальном определении не превышает 0,4, при спектрофотометрическом - 0,2. Метод позволяет проводить анализ левомицетина при содержании его 0,05 мг/кг продукта и выше.

Аппаратура, материалы и реактивы:

Гомогенизатор тканей; спектрофотометр СФ-26 или аналог; термостат; азот, поверочный нулевой газ; центрифуга настольная; ротационный испаритель с ловушкой; баня масляная или глицериновая; камера для тонкослойной хроматографии с притертой крышкой; пластины для тонкослойной хроматографии «Силуфол» размером 15х15 см, ЧСФР или Сорбфил 100х100 (г.Краснодар); ножницы; весы технические; весы аналитические; линейка; карандаш графитовый; цилиндры мерные вместимостью 50 и 100 см³; колбы плоскодонные на 25 и 100 см³; колбы мерные на 25 см³; пипетки на 5 и 10 см³; колбы для упаривания на 25 и 50 см³; микрошприц на 10 и 25 мкл; натрий сернокислый, безводный; серная кислота, х.ч., 1 н раствор; этилацетат, х,ч.; натрий хлористый, насыщенный раствор в воде; натрий углекислый, х.ч., 2% водный раствор; ацетонитрил; петролейный эфир, фракция 40-70° С; метанол; β-глукуронидаза, водный раствор 1 мг/мл; вода дистиллированная; кислота соляная, конц.; хлорид олова (II), восстанавливающий реактив: 3 см 15% раствора SnCl₂ (в воде) + 15 см³ НСl_конц.+180 см³ Н₂О; левомицетин; однозамещенный фосфат калия; двузамещенный фосфат натрия.

Отбор и подготовка проб: Способ отбора и подготовки проб указан в нормативно-технической документации на конкретную продукцию.

Извлечение левомицетина из пищевых продуктов и концентрирование экстракта:

Мясо, мясные продукты. 10±0,1 г гомогенизируют с 15 см³ 0,025 М фосфатного буфера, рН 6,88 (0,34 г КН₂РО₄ и 0,36 г Nа₂НРО₄ растворяют в 100 см³ дистиллированной воды), добавляют 200 мкл водного раствора β-глукуронидазы и инкубируют 1,5 часа при 37° С. Гомогенат экстрагируют 3х30 см³ этилацетата, при необходимости применения для расслоения суспензии центрифугирование 5-10 мин при 4000 об/мин. Этилацетатный слой объединяют.

Молоко, молочные и кисломолочные продукты (при анализе сметаны ее разбавляют в 2,5-5 раз в зависимости от жирности, сыры и творог гомогенизируют с водой до получения гомогенной массы).25±0,1 см³ насыщают 10 г Na₂SО₄, приливают 40 см³ этилацетата и 5 см³ 1 н Н₂SО₄, интенсивно встряхивают 1-2 мин. Для расслоения эмульсии применяют центрифугирование 5-10 мин при 4000 об/мин. Этилацетат декантируют, а супернатант экстрагируют последовательно 30 и 20 см³ этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование для расслоения.

Яйцо (яичный порошок предварительно разводят водой до консистенции жидкой сметаны). 10±0,1 г гомогената яйца перетирают с 5 г Na₂SО₄, приливают 40 см³ этилацетата и 5 см. 1 н Н₂SО₄, перемешивают и центрифугируют 5-10 мин при 4000 об/мин. Этилацетатный слой декантируют, а водную часть экстрагируют последовательно 30 и 20 см³ этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование для расслоения. Объединенные этилацетатные экстракты из продуктов промывают последовательно 10 см³ 2% раствора Nа₂СО₃, насыщенного NаС1 и 10 см³ насыщенного раствора NаСI.

Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 50° С до минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха этилацетата, добавляют 3 см³ смеси ацетонитрил – вода 1:4 и экстрагируют 3·5 см³ петролейного эфира. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин этилацетатом (3х5 см³). Этилацетатный экстракт сушат над Na₂SО₄ (1 г), декантируют, промывают 3 см³ этилацетата сульфат натрия, объединяют его с экстрактом и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 50° С досуха. Остаток растворяют в 200 мкл метанола.

Хроматографическое разделение: идентификация и ориентировочная оценка концентрации левомицетина в экстракте.

Приготовление стандартных растворов: Отвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 см³ и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина – 1 мг/см³. 0,25 см³ полученного раствора помешают в мерную колбу на 25 см³ и разбавляют метанолом. Концентрация левомицетина в стандартом растворе 10 нг/мкл.

Хроматографическое разделение: На пластинку для тонкослойной хроматографии наносят (рис. 2 А): в точки 1,3 и 5 соответственно 1,2 и 4 мкл раствора стандарта, а в точки 2 и 4 соответственно 3 и 10 мкл концентрированного экстракта.

Пластинку помещают в камеру для ТСХ и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-метанол 10:1. По достижении фронтом элюента верхнего края пластинки, ее вынимают, сушат, опрыскивают раствором SnCl₂ в НС1, оставляют на 15 мин и опрыскивают раствором n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен на хроматографической пластинке, по оттенку и R_f соответствующих пятнам стандарта, свидетельствует о возможном присутствии левомицетина в продукте. Сравнивая интенсивность окраски пятен стандартов и опытной пробы, ориентировочно оценивают содержание левомицетина в экстракте.

Подтверждение наличия левомицетина в пробе: Аликвотную часть экстракта (50-100 мкл) упаривают досуха, добавляют 150 мкл 10% раствора НС1, греют на масляной бане при температуре 98° С в течение 30 мин, отдувая досуха азотом и приливают 200 мкл 2% метанольного раствора Na₂СО₃.

На хроматографическую пластинку наносят 1-10 мкл полученной пробы и соответствующее количество стандарта левомицетина (с учетом предварительной оценки содержания левомицетина в экстракте); пластинку помещают в камеру для ТСХ и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода 12:5:4:2.

По достижении фронтом элюента верхнего края пластинки, ее вынимают, сушат, опрыскивают раствором SnСl₂ в НСl, оставляют на 15 мин и вновь опрыскивают раствором n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен на хроматографической пластинке по оттенку и R_f соответствующих пятнам стандарта, подтверждает наличие левомицетина в продукте.

Количественное определение и расчет содержания левомицетина в продукте: При необходимости точного количественного определения левомицетина в пищевом продукте на хроматографическую пластинку наносят в несколько точек, близко расположенных друг к другу, аликвотную часть экстракта и таким же образом раствор стандарта, так, чтобы количество левомицетина в нем было близко к установленному в пробе при ориентировочной визуальной оценке. Пластинку хроматографируют и опрыскивают как в п.

Хроматографическое разделение: Вырезают зоны левомицетина в опытной пробе, стандарта и соответствующую по R_f и площади зону на пластинке, служащую контролем (рис.2Б). Зоны элюируют 3х1 см³ метанола, метанол упаривают досуха, приливают 200 мкл 5% раствора SnCl₂ в 5% НСl, греют при температуре 98° С в течение часа; пробы охлаждают, добавляют по 2 см³ 1% раствора n-диметиламинобензальдегида в метаноле, 1 см³ метанола и измеряют оптическую плотность полученных растворов опытной пробы и стандарта относительно контрольной пробы на спектрофотометре в кюветах с 1=10 мм при λ = 430 нм.

Рассчитывают содержание левомицетина в пробе продукта по формуле:

К - коэффициент, учитывающий полноту извлечения левомицетина из пищевого продукта и равный: 1,33 для мяса; 1,13 - для молока и 1,25 - для яиц; ОП_о - оптическая плотность элюата опытной пробы, относ. ед.; ОП_ст. - оптическая плотность элюата стандарта, относ. ед.; Р - количество стандарта левомицетина, нанесенного на пластинку, мкг; V - объем анализируемой пробы, мкл; М - масса образца пищевого продукта, кг (л). Интервал определяемых масс левомицетина составляет 0,5-6,0 мкг. Вычисления проводят до второго десятичного знака. За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает 20%. Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.

а. линия фронта б.

растворителей

10см

I II III

1 2 3 4 5 линия старта

Рис. 2 Схема нанесения на хроматографическую пластинку стандарта и аликвотных частей экстракта из продукта: а) при визуальной оценке содержания левомицетина в пробе: 1, 3, 5 – точки нанесения 1, 2, 4 мкл раствора стандарта соответственно; 2, 4 – точки нанесения экстракта 3 и 10 мкл соответственно; б) при количественном определении: I, II и III – зоны опытной пробы, стандарта и контроля соответственно.

Контрольные вопросы:

1. В чём заключается хроматографический метод анализа?

2. Основные принципы метода тонкослойной хроматографии?

3. Каковы свойства левомицитина?

4. Сущность метода тонкослойной хроматографии левомицитина?

5. Особенности экстракции левомицитина из пищевых продуктов?