Визначення взаємодії генотипу та довкілля в прояві патологічних ознак людини

Усі ознаки генетично зумовлені, але кожна з них по-різному змінюється під впливом середовища.

Якісні ознаки змінюються під впливом середовища значно мен-І ше, ніж кількісні. Прикладом зміни кількісної ознаки може бути! молочність у корови. Надої молока в природних умовах — 1000 кгі на рік, а внаслідок селекції вони можуть становити 7000 кг і біль-1 ше. Якісні ознаки мають вузьку норму реакції, а кількісні — ши-| року. Норма реакції генетично зумовлена.

Яскравим прикладом впливу середовища на організм є пору-1 шення здоров'я в осіб, які перенесли гостру променеву хворобу] (ГПХ) після аварії на Чорнобильській АЕС.

Цитогенетичний, біохімічний методи та днк-діагностика

Цитогенетичний метод

За допомогою цитогенетичного методу вивчають структуру хромосом, каріотип людини, статевий хроматин, а також діагнос­тують захворювання, пов'язані з цими порушеннями.

Основні методи цитогенетики: каріотипування і виявлення статевого хроматину.

Каріотип досліджують на стадії метафази, коли хромосоми перебувають в одній площині. Вони максимально спіралізовані, стовщені, і тому структура хромосоми в цей період клітинного ци­клу виражена найчіткіше. Досліджувати каріотип досить склад­ко, оскільки кількість хромосом у клітинах людини велика (46), а в метафазній пластинці часто одна хромосома розміщується на іншій. Метод вивчення каріотипів дає змогу діагностувати спад­кові захворювання, причиною яких є зміни в структурі й кількос-іі хромосом.

Хромосомний аналіз складається з двох етапів:

• візуального аналізу хромосомних препаратів;

• аналізу хромосом порівняно з їхнім нормальним каріоти­пом.

Кожна соматична клітина організму має однаковий набір хро­мосом і вони ідентичні в усіх клітинах, тому для дослідження каріотипу може бути використана будь-яка клітина організму: зі шкіри, кісткового мозку, але найдоступнішими є клітини кро­ві — лейкоцити (лімфоцити). Досліджують каріотип у цитогене-тичній лабораторії.

Для того щоб визначити каріотип, потрібно:

1. Узяти з вени 8—10 мл крові. її можна зберігати кілька днів у холодильнику чи транспортувати в спеціальних лабораторіях.

2. Лейкоцити виділяють шляхом осадження еритроцитів цен­трифугуванням або 10 % розчином желатину.

3. У стерильних бюксах лейкоцити поміщають у культуру тка­нини — спеціальне середовище зі значною кількістю інгредієнтів (близько 50). Обов'язковим компонентом середовища є білок рос­линного походження — фітогемаглютинін, який стимулює лім­фоцити до поділу.

4. Потім спеціальні флакони з культурою ставлять у термостат па 72 год (3 доби) за температури 37 *С; деякі клітини культури 11 оминають ділитися.

5. За 60 хв до фіксації в культуру додають слабкий розчин ал­калоїду колхіцину, який затримує процес поділу клітин на стадії метафази (фіксує мітоз).

6. З розчину колхіцину культуру переносять на кілька хвилин у гіпертонічний розчин натрію хлориду. У цьому розчині клітини і хромосоми набрякають, унаслідок чого відбувається легкий роз­рив оболонки ядра (через різний осмотичний тиск), і хромосоми переходять у цитоплазму. Потім хромосоми фіксують.

і;-

1. Після попередніх операцій клітини переносять на предмет­не скло і забарвлюють ядерними барвниками — ацеторсеїном за методом Романовського—Гімзи або Фельгена.

2. Забарвлену культуру, закриту покривним склом, розгляда­ють у світловий мікроскоп з імерсією.

3. За допомогою спеціальної приставки до мікроскопа хромо­соми фотографують.

10. Зі збільшеної мікрофотографії акуратно вирізують усі хр мосоми. Гомологічні розкладають у такому порядку: на першому місці — найбільші (1-а пара), у кінці — найменші (22-а пара), а на останньому місці — статеві хромосоми (23-я пара). Таким чинол( отримують ідіограму.

11. Після цього аналізують ідіограму. Аналіз ідіограми

1. Визначають загальну кількість хромосом.

2. Визначають статеві хромосоми.

3. Записують каріотип людини. Для цього спочатку вказуютьі загальну кількість хромосом, потім ставлять знак «кома» і в кінці вказують статеві хромосоми. Наприклад, 46, ХУ — нормальний каріотип чоловіка; 46, XX — нормальний каріотип жінки. Каріо-І тип можна записати і так: спочатку вказують кількість аутосом (нестатевих хромосом), потім знак "плюс" і вказують статеві хро-| мосоми: 44+ХХ — нормальний каріотип жінки; 44+ХУ — нор­мальний каріотип чоловіка.

4. Додаткову хромосому позначають відповідним номером і] знаком "плюс"; відсутню (втрачену) хромосому також познача­ють відповідним номером і ставлять знак "мінус".

Наприклад: 47, ХУ, 21+ (чоловік з трисомією 21-ї пари, хво­роба Дауна); 47, XX, 21+ (трисомія 21-ї пари в жінки, хвороба Дауна).

Полісомію статевих хромосом можна записати так: 47, XXX (синдром трисомії — X); 47, ХХУ (синдром Клайнфелтера).

Запис моносомії: 45, XX (21-). Моносомію статевих хромосом записують так: 45, Х0; 45, У0.

Метод виявлення статевого хроматину

У 1948 р. М. Барр і Ч. Бертман досліджували нейрон кішки і звернули увагу на інтерфазне ядро клітини, яке має інтенсив­но.

забарвлене тільце. Його виявили лише в ядрах клітин самок, а в самців його немає. Це тільце є в клітинах багатьох тварин, але тільки в особин жіночої статі. Воно отримало назву статевого хро­матину, або тільця Барра (мал. 13).

Х-статевий хроматин — це спіралізована, неактивна Х-хромосома. У жінок дві Х-хромосоми, одна з яких спіралізована її неактивна. Саме вона й має вигляд глибки (тільце Барра). Якщо в клітині більше двох Х-хромосом, то й тілець Барра буде більше двох. Із двох Х-хромосом у жінки активна лише одна. У разі на­явності зайвого або відсутності тілець Барра можна діагностувати спадкові захворювання, які пов'язані зі зміною кількості стате­вих хромосом. Наприклад, у жінок із синдромом трисомії-Х (47, XXX) буде дві глибки статевого хроматину, а в жінки із синдро­мом Шерешевського—Тернера (45, ХО) статевого Х-хроматину взагалі не буде.

Щоб визначити кількість тілець статевого Х-хроматину в клі­тині, треба від загальної кількості Х-хромосом відняти одиницю. Наприклад, каріотип хворої 47, XXX, необхідно визначити кіль­кість тілець Х-хроматину. Для цього від трьох (три Х-хромосоми) віднімаємо одиницю, отримуємо два. Отже, розрахувати кіль­кість тілець Х-статевого хроматину можна за формулою

А-1 = В, де А — кількість Х-хромосом у каріотипі; В — кількість тілець Х-хроматину.

Для того щоб за кількістю тілець Х-хроматину визначити кіль­кість Х-хромосом у каріотипі, потріб­но до кількості тілець Х-хроматину додати одиницю.

Наприклад, у жінки в клітинах букального епітелію слизової оболон­ки ротової порожнини виявлено дві глибки статевого хроматину. Скільки Х-хромосом у каріотипі цієї жінки?

Визначаємо за формулою

В+ 1=А,

Мал. 13. Х-хроматин (1) у клітині щічного (букально­го) епітелію жінки

де В — кількість тілець Х-хроматину; А — кількість Х-хромосом. Підставляємо значення: 2+1 = 3. Слід також знати, що зазвичай у клітинах нормального чоло­вічого організму буває деяка кількість псевдотілець Барра (кон­денсованих ділянок аутосом і спіралізованих У-хромосом), Отже, у процесі діагностування різних хромосомних захворювань слід уміти відрізняти ¥-статевий хроматин від типового статевого Х-хроматину, утвореного зайвою спіралізованою Х-хромосомою.

Біохімічний метод

За класифікацією ВООЗ, спадкові дефекти обміну речовин зу­мовлені порушеннями:

1. амінокислотного обміну;

2. вуглеводного обміну;

3. обміну ліпідів;

4. стероїдного обміну;

5. пуринового і піримідинового обміну;

6. обміну речовин у сполучних тканинах, кістках і м'язах;

7. структури гема і порфірину;

8. обміну речовин в еритроцитах та їхньої структури;

9. обміну металів;

10) транспортування різних речовин;

11) спричинені аномаліями будови й функції ферментів та білків плазми.

Більшість спадкових порушень обміну речовин — це ензи-мопатії, або ферментопатії, тобто порушення структури білків-ферментів (унаслідок мутації генів). У разі ензимопатії в організ­мі спостерігається дефіцит кінцевих продуктів обміну речовин і накопичення проміжних продуктів, які можна виявити в крові, сечі й інших біологічних рідинах біохімічними дослідженнями.

Виявлення порушень обміну речовин за допомогою біохіміч­них методів проводять у два етапи.

На першому етапі використовують прості скринінг-тести (від англ. зкгепіп£ — просіювання). Це програми "просіювання". За допомогою таких програм на першому етапі відбирають можливі випадки захворювання.

На другому етапі за допомогою точніших і складніших мето­дів діагноз уточнюють.

Щоб виявити порушення обміну речовин, найчастіше дослі­джують кров, сечу, застосовуючи різні реактиви.

Біохімічні дослідження проводять тоді, коли наявні:

1. Тривала жовтяниця нез'ясованої етіології в дітей у період новонародженості й перші місяці життя.

2. Хронічні розлади травлення нез'ясованої етіології: пронос, блювання, гепатомегалія, цироз, утруднене вигодовування.

3. Аномалії розвитку скелета нерахітичного походження (по­рушення ходи, затримка фізичного розвитку, різні форми гіпо­трофії), які не усуваються корекцією харчування.

4. Порушення зору: зниження гостроти зору, вивих або підви­вих кришталика, катаракта, помутніння рогівки, ністагм.

5. Мовні порушення: алалія, дислексія.

6. Зниження слуху або повна глухота.

7. Алкалоз, ацидоз, гіперглікемія, кома, анемія.

8. Аномалії розвитку зовнішніх статевих органів.

9. Неадекватна поведінка, рухове розгальмування, м'язова гі­потонія чи гіперрефлексія.

10. Незвичайний вигляд волосся, нігтів і обличчя, нирково­кам'яна хвороба, гіпер- і гіпопігментація, спленомегалія, тром-боемболічна хвороба, світлобоязнь, висип на шкірі, екзема.

11. Стійкі зміни в сечі: протеїнурія, гематурія, лейкоцитурія, фосфатурія, глікозурія.

12. Судомний синдром, що не піддається лікуванню; зміни на ЕЕГ, ЕКГ; олігофренія.

ДНК-діагностика

Останнім часом поширюється найновітніший метод діагности­ки генних захворювань — ДНК-діагностика. Відомо, що молеку­ла ДНК індивідуальна для кожного організму.

Для ДНК-діагностики можна використовувати будь-які клі­тини плода.

На початку 80-х років XX ст. набув поширення метод проме-тафазних хромосом, який дає змогу підтвердити існування мі-крохромосомних мутацій-мікроделецій, мікродуплікацій, пара-центричних інверсій. Ґрунтуючись на його застосуванні, вдалося виділити серед мультифакторіальних хвороб групу мікротом-них синдромів (Прадера—Віллі, Ангельмана, Ді Георге, Голта— Орама, котячого крику, міодистрофії Дюшенна—Беккера, нейро­фіброматоз І і II типу тощо). Виявилося, що деякі мікроперебудо-ви супроводжують не лише названі синдроми, а й рак. Близько 10 % мультифакторіальних хвороб (майже 500 нозологічних оди­ниць) проявляються неоплазією, і серед них приблизно половина супроводжується хромосомними перебудовами.

Провідна роль у вивченні спадковості людини належить молекулярно-цитологічним і молекулярно-біологічним методам. Наприклад, метод флюоресцентної іп зііи гібридизації (ГІ8Н-метод) має певні переваги: точна локалізація гібридизаційного сигналу на хромосомі, проведення аналізу протягом 2—3 днів, безпечна нерадіоактивна мітка.

Особливе місце в клінічній генетиці посідає ДНК-зондова діа­гностика. Тільки вона з абсолютною точністю дає змогу досліди­ти і встановити причину захворювання будь-якого походження. ДНК-діагностику проводять за допомогою молекулярного зон­да, завдяки якому можна розпізнати нуклеотидну послідовність ДНК-зміненої хромосоми.

Для цього виділяють незначну кількість хромосомної ДНК лімфоцита, розрізають її рестриктазами на фрагменти, визна­чають у них послідовність нуклеотидів, а потім проводять гібри­дизацію цих фрагментів з міченою ДНК, визначають серед них гомологічні, проводять електрофорез і за відхиленням гібридоло­гічних смуг виявляють дефекти в молекулі ДНК. Ці дослідження потрібно проводити в родинах, де є захворювання з пізнім вияв­ленням патологічного гена.

За допомогою ДНК-діагностики можна проводити ефективну пресимптоматичну, пренатальну й навіть преімплантаційну діа­гностику деяких мультифакторіальних хвороб вже в І триместрі вагітності. Це стосується гемофілії А і В, муковісцидозу, міоди-строфії Дюшенна—Беккера, фенілкетонурії тощо.

У разі хвороби Вільсона—Коновалова, адреногенітального синдрому пренатальна ДНК-діагностика дає можливість провес­ти профілактичне допологове лікування, яке значно знижує тяж­кість хвороби в новонародженого.

Пресимптоматична ДНК-діагностика має вирішальне значен­ня в плануванні сім'ї і при загрозі хореї Гентінґтона.

За допомогою ДНК-діагностики можна виявити гетерозиготне носійство патологічного гена в тих випадках, коли інші методи виявляються неефективними. Цим методом можна одержати ге­нетичний паспорт кожної особи.

Метод дерматогліфіки

"Читання по руці", або хіромантія, походить зі Стародавньої Індії, поширилося в країнах Малої Азії, Середземномор'я і Китаї, а звідти — в Європі та інших країнах світу. Існують свідчення про те, що давні єгиптяни, вавилоняни, ассирійці, китайці часто ви­користовували відбитки пальців як печатки або підписи на доку­ментах, оскільки малюнок на пальцях у кожної людини індиві­дуальний. Отже, ще в давнину з'явилося мистецтво "читання" по лініях, складках, горбках долонної поверхні кисті (мал. 14).

Згодом з'явилася спеціальна галузь знань — дерматогліфіка, яка вивчає рельєф шкіри на пальцях, долонях та підошвах ступ­нів. Дерматогліфіку широко застосовують для ідентифікації осо­би, бо малюнок на пальцях і долонях індивідуальний, зумовлений спадковістю й не змінюється протягом усього життя людини.

Дерматогліфіка займається вивченням малюнків на шкірі пальців — дактилоскопія, долонь — пальмоскопія; підошов ступ­нів — плантоскопія. Для отримання відбитків малюнків на шкірі використовують найпростіший та найнадійніший метод із засто­суванням друкарської фарби (мал. 15).

Н а сьогодні відомі дерматогліфічні особливості відбитків кис­тей залежно від різних син­дромів. За допомогою цього методу можна також ви­значити, яка саме аномалія (трисомія 21-ї пари чи тран-слокація) спричинила хво­робу Дауна.

₉

Дерматогліфі чні дослі­дження дали можливість ви­явити ознаки, які характерні для різних видів хромосомної та генної патології,

приро­джених вад розвитку життєво важливих

органів і систем. Завдяки ретельному обстеженню

малюнків на кінцевих фалангах пальців кисті встановлено певну за кономірність між сумарною

величиною гребінцевого рахунку і порушеннями статевої дифе­ренціації. Ця закономірність полягає в тому, що чим більша кіль­кість Х-хромосом у каріотипі індивіда, тим менше змін у папіляр­них лініях. Отже, дактилоскопічні обстеження можна проводити в разі порушення менструального циклу, безплідності, мимовіль­них викиднів та за інших форм порушення генеративної функції й статевого диференціювання. Установлено також успадкування типів пальцевого візерунка в нащадків.

Різні дерматогліфічні особливості виступають як генетичні маркери, які з певною ймовірністю свідчать про порушення, вка­зують на ступінь ризику хвороби та схильність до неї.

З'ясовано, що чим більше відхилень, які корелюють із захво­рюваннями, у дерматогліфічному малюнку, тим вищий ризик носійства спадкових порушень. Вони згодом можуть розвинутися в патологію, особливо за наявності помітних змін макрорельєфу шкірної поверхні долоні.

Ідентичних відбитків пальців у різних осіб немає, тому метод дерматогліфіки (дактилоскопія) поширений у криміналістиці й судово-медичній практиці. За допомогою цього методу також ви­значають зиготність близнюків (тільки в М2-близнюків малюнок буде подібним) та діагностують деякі захворювання, встановлю­ють батьківство.

Метод гібридизації соматичних клітин

Соматичні клітини містять увесь обсяг генетичної інформації. Це дає можливість вивчати багато питань генетики людини, які неможливо досліджувати на цілому організмі. Соматичні кліти­ни людини отримують із різних органів (шкіри, кісткового моз­ку, клітин крові, тканин ембріонів). Найчастіше використовують клітини сполучної тканини (фібробласти) та лімфоцити крові. Культивування клітин поза організмом дає змогу отримувати достатню кількість матеріалу для дослідження, який не завжди можна взяти в людини без шкоди для здоров'я.

Клітини культури тканини можна використовувати для ви­вчення різними методами: цитологічним, біохімічним, імуноло­гічним тощо. Таке дослідження може бути в ряді випадків точ­нішим, ніж на рівні цілісного організму, бо метаболічні процеси вдається виділити зі складного ланцюга взаємопов'язаних реак­цій, які відбуваються в організмі.

У 1960 р. французький біолог Ж. Барський, вирощуючи поза організмом у культурі тканини клітини двох ліній мишей, вия­вив, що деякі клітини за своїми морфологічними і біохімічними ознаками були проміжними між вихідними батьківськими клі­тинами. Ці клітини виявилися гібридами. Таке спонтанне злит­тя клітин у культурі тканини відбувається досить рідко. Згодом виявилося, що частота гібридизації соматичних клітин підвищу­ється при введенні в культуру клітин РНК-умісного вірусу пара-грипу Сендай, який, як і взагалі всі віруси, змінює властивості клітинних мембран і робить можливим злиття клітин. Вірус Сен­дай попередньо опромінювали ультрафіолетовими променями. Він втрачав свої вірулентні властивості, але зберігав здатність впливати на злиття клітин. У змішаній культурі двох типів утво­рюються клітини, які містять у спільній цитоплазмі ядра обох батьківських клітин, — гетерокаріони. Більшість гетерокаріонів

гине, але ті, які містять тільки два ядра, часто продовжують свій розвиток, розмножуючись поділом. Після мітозу і подальшого поділу цитоплазми з двоядерного гетерокаріону утворюються дві одноядерні клітини, кожна з яких є синкаріоном — справжньою гібридною клітиною, яка має хромосоми обох батьківських клі­тин.

Гібридизація соматичних клітин проводиться не тільки між різними видами, а й типами: людина і миша, людина і комар, муха і курка тощо.

Використання методу гібридизації соматичних клітин дає змогу вивчати механізми первинної дії і взаємодію генів. Куль­тури соматичних клітин використовуються для визначення мута­генної дії факторів навколишнього середовища. Розширюються можливості точної діагностики хвороб на біохімічному рівні в до­рослих і до народження в плодів (пренатальна діагностика). Для подальшого удосконалення цих методів потрібно нагромаджува­ти лінії клітин з генними і хромосомними мутаціями. Вже органі­зовані "банки" клітинних ліній.