Використання газорідинної хроматографії в екологічних дослідженнях.

Газова хроматографія - один з багатьох видів хроматографії. Описана уперше в 1952 р. вона стала популярною завдяки:

• швидкості і легкості, з якою можуть бути проаналізовані складні суміші;

• дуже малої необхідної проби для аналізу;

• гнучкості і надійності використовуваного устаткування.

Газорідинна хроматографія (ГЖХ). Для визначення залишків хлорорганічних, фосфорорганічних і інших пестицидів все більше застосування знаходить ГЖХ, яка служить інструментальним методом, що дозволяє з високою точністю і більшою чутливістю визначати зміст залишків пестицидів в різних об'єктах.

Суть методу полягає в тому, що багатокомпонентна суміш різних хімічних речовин розділяється на окремі компоненти в колонках з рідкою фазою; нанесеною на твердий носій, при пропусканні через колонку екстрактів з проби, перетворених на газоподібний стан за допомогою газу-носія, функції якого частіше виконує інертний газ — азот. Розділені на колонці на окремі інгредієнти компоненти суміші уловлюються за допомогою різного типу детекторів, а потім реєструються на стрічці самописця, у вигляді окремих піків. Час появи піку на хромато-грамме (час утримування) за строго певних умов хроматографирования для кожної хімічної сполуки постійно, що складає основу для його ідентифікації. Висота або площа піку відповідає кількісному його змісту і використовується для визначення кількості хімічної речовини в аналізованій пробі.

Для визначення залишків ХОП в кормах і інших об'єктах за допомогою ГЖХ застосовують газові хроматографы вітчизняного або зарубіжного виробництва (серії «Колір», «Газохром», фірм «Вариан», «Перкин-Эльмерк» та ін.), обладнані детектором електронного захоплення (ДЭЗ) або детектором постійної швидкості рекомбінацій (ДПР), який є одним з варіантів ДЭЗ.

Офіційного методу визначення ХОП в кормах за допомогою ГЖХ немає. Є лише метод визначення ізомерів ГХЦГ (В. М. Белоносов, В. В. Єрмаков, 1974). Для аналізу суміші, що включає альфа- і гамма-ізомери ГХЦГ, гептахлор, альдрин, епоксид гептахлору, п, п1 ДДЭ, п, п1 ДДД і п, п1 ДДТ, за допомогою ГЖХ можна використати наступний метод.

Фазові системи

Цей термін в газовій хроматографії означає комбінацію використовуваних рухливою і нерухомою фаз.

Нерухома фаза складається з твердих часток, переважно з вузьким інтервалом по розмірах. Їх середній розмір звичайні 0,1-0,3 мм, хоча в деяких випадках для досягнення дуже високої ефективності газохроматогра-фических колонок використовуються частки меншого розміру. З точки зору хімічного складу і властивостей використовувані нерухомі фази можуть бути підрозділені на три групи.

1) адсорбенти, зазвичай з дуже великою питомою поверхнею (50-1000 м2/г) : силікагель, оксид алюмінію, молекулярні сита, активне вугілля і графітована сажа. Газоадсорбційна хроматографія — не дуже поширений метод, за винятком аналізу газів або рішення особливих завдань;

2) нейтральні, або так звані інертні носії, зазвичай отримують з діатомітових матеріалів, іноді з полімерів.

На них наноситься рідина з дуже низьким тиском пари і високою термічною стабільністю в умовах використання колонки. Нині газорідинна хроматографія є найпоширенішим методом.

У газовій хроматографії найчастіше використовуються наступні інертні носії: карбопак (А, В, С), хромо-сорб (A, W, G, Р), молекулярні сита, графітована сажа, цеоліти та ін.

Використання методу газорідинної хроматографії при діагностові БВ засноване на ідентифікації групи речовин - продуктів метаболізму мікроорганізмів, пов'язаних з БВ, і мікроорганізмів, присутніх в нормі. До числа таких метаболитов відносять леткі жирні кислоти (оцтова, изопропионовая, пропіонова, ізомасляна, масляна, ізовалеріянова, валеріанова) і нелеткі органічні кислоти (молочна і бурштинова).

В якості матеріалу для дослідження використовуються змиви вагінального відокремлюваного у фізіологічному розчині. Для цього в піхву вводиться 3 мл стерильного фізіологічного розчину, робиться змив вагінального вмісту із стінок піхви ватним мікробіологічним тампоном і переноситься в пробірку з притертой пробкою. Для аналізу летких жирних кислот готуються їх ефірні екстракти. До 1 мл зразка додається 0,5-1 мл діетилового ефіру і екстрагується в пробірці з шліфом в течії 1 хвилини за допомогою мініцентрифуги "Vortex". Після цього ефірний екстракт відділяється, використанням пастерівської піпетки з невеликою кількістю безводого сульфату магнію. Для аналізу нелетких компонентів зразок піддається метилуванню: до 2 мл змиву додають 4 мл метанолу, пробірку закривають плівкою і на 45 хвилин поміщають в морозильну камеру при температурі -200С. Далі рідина переливається в герметичну пробірку і до неї додається 0,2 мл 50% розчину сірчаної кислоти, після чого пробірка витримується в течії 30 хвилин при +800С. Після закінчення процесу етерифікації вміст пробірки охолоджується проточною водою і в неї додається 2 мл дистильованої води. Для екстракції летких ефірів використовується 1 мл хлороформу. 1 мкл підготовлених екстрактів вводиться в инжектор-хроматограф за допомогою мікрошприця. Як еталон використовуються екстракти водних розчинів летких жирних кислот і нелетких органічних кислот (зовнішній стандарт).

В якості нерухомої фази в газорідинній хроматографії найчастіше використовуються: апиезон М, карбо-вакс 20М, карбовакс 1500, дексил 300, дексил 400, дибутил-фталат, диэтилен-гликольадипат, динонилфталат, полифе-ниловый ефір, полипропиленгликоль, полівінілпіролідон, силікон GESF 96, силікон GEXE 60, силікон SE 30, феніл-силікон SE 52 та ін.;

3)для проведення дуже важких розділень успішно використовуються також адсорбенти з нанесеною на них малою кількістю рідини з низьким тиском пари. Цей метод зазвичай називається газовою хроматографією на адсорб

ционных шарах або газоадсорбційною хроматографією на модифікованих адсорбентах.

Рухливою фазою служить інертний газ (гелій, азот, аргон) або такий газ, як водень, який в умовах газової хроматографії проявляє себе як інертний. В деяких випадках використовують водяну пару або безводий аміак. Хімічний склад газу-носія робить дуже незначний вплив на утримування речовин і на їх розділення.

З іншого боку, фізичні властивості рухливої фази і особливо значна стисливість газів, велике значення коефіцієнта дифузії і велика відмінність між парціальними молярними об'ємами в рухливій і нерухомій фазах мають істотний вплив і є причиною значних відмінностей між газовою хроматографією і рідинною.

Схематичний опис газового хроматографа

Є багато практичних реалізацій принципів газової хроматографії, проте по своїх основних конструктивних особливостях уся ГХ-апаратура дуже сходу. На мал. 4.5 приведений схематичний опис газового хроматографа.

Основними блоками газового хроматоргафа є наступні:

• Блок підготовки газу-носія, який подає стаціонарний потік вибраного газу-носія. У найпоширеніших системах використовується регулятор швидкості потоку. Масова швидкість потоку газу-носія через цей регулятор підтримується постійною. Іншими словами, число мілі газу, що проходить через колонку в одиницю часу, є постійним.

• Система введення проб, яка забезпечує введення точної кількості проби в цей потік газу точно в початок колонки. Ця проба повинна випаровуватися за досить короткий час і вводитися в колонку у вигляді циліндричної пробки пари, розбавленої газом-носієм.

• Колонка, яка встановлена в термостаті з регулюванням температури. Вибирана температура зазвичай полягає в діапазоні від кімнатної температури до 350°З, хоча були описані аналізи в ширшому діапазоні (від - 180 З до +1000°С).

• Детектор, який забезпечує сигнал, пропорційний складу газу-носія. Бажано, щоб цей сигнал був нульовим, коли з колонки виходить чистий газ-носій, і пропорційним концентрації будь-якої речовини, що відрізняється від газу-носія. Такий детектор називається лінійним. Якщо коефіцієнт пропорціональності однаковий для усіх речовин, детектор називається ідеальним. На практиці ідеальний детектор не існує.

Компоненти суміші переносяться по колонці газом-носієм. Вони рухаються зі швидкістю, яка пропорційна лінійній швидкості газу-носія, але менше її і залежить від сили взаємодії кожного з цих компонентів з нерухомою фазою.

Відповідно, якщо нерухома фаза була вибрана правильно, кожен компонент знаходиться в колонці або елююється різний час і відділяється від інших компонентів. Сигнал детектора дозволяє проводити "Ідентифікація" ідентифікацію кожного компонента за часом елюювання його зони (що також називається його часом утримування) і його кількісне визначення за величиною сигналу детектора (його висоті або площі).

Таким чином, хроматографічний процес є послідовним процесом. Кожному введенню проби відповідає розділення, що супроводжується детектуванням.

Експериментальні хроматографическиеданные

З даних, записуваних під час хроматографічного аналізу, можна відмітити п'ять параметрів для кожного піку, допускаючи, що він досить добре відокремлений від соседнихпиков (мал. 4.6).

Цими п'ятьма основними експериментальними даними є: час утримування, час затримки газу, ширина піку, висота піку, площа піку.

1. Час утримування tR.

Цей час між введенням проби і появою на виході з колонки максимальної концентрації зони відповідної речовини. За часом утримування проводиться ідентифікація речовин, що розділяються.

2. Час затримки газу tm. Цей час утримання інертної речовини, яка не утримується на колонці, т. е. речовини, що не адсорбованої або не розчиняється нерухомою фазою.

3. Ширина піку w. Ширина піку зазвичай визначається як довжина сегменту нульової лінії, вимірювана між точками перетину з нульовою лінією двох дотичних в точках перегину піку. Використовується також ширина піку на половині його висоти або на деякій іншій проміжній висоті.

4. Висота піку h.

Ця відстань між нульовою лінією і максимумом піку.

5. Площа піку А, яка нині вимірюється інтеграцією сигналу. По площі піків проводиться кількісний аналіз.

Для проведення газорідинної хроматографії можливе використання хромотографа "Chrom-5". Хромотограф "Chrom-5" оснащений пламенноионизационным детектором і скляними колонками, заповненими сорбентом FFAP 15% на Chromosorb W, 80-100 mesh. Робочі умови: температура випарника - +1900С, термостата - +500С, детектора - +2500С. Швидкість газу-носія (азоту) і водню 30 мл в хвилину, повітря - 300 мл в хвилину. Ідентифікація аналізованих речовин проводиться з учетем часу їх утримування, а концентрації аналізованих речовин визначаються по площі піку на хромотограмме. Интерпритация результатів проводиться відповідно до керівництва по мікробіології і хроматографії.

Метод газорідинної хроматографії дозволяє порівняти зміст у вагінальному відокремлюваному основних продуктів метаболізму лактобактерій і облігатно-анаеробних мікроорганізмів - молочною і бурштиновою кислот. У нормі співвідношення бурштинової і молочної кислот складає 0,4, а при БВ більше 0,4.

Чутливість і специфічність методу варіюють і, за даними, зарубіжних авторів, складають від 78-81% до 100% [11]. За даними Анкирской А.С. і співавт чутливість і специфічність методу складають 80% і 88,6% відповідно [2]. При БВ також виявляють високі концентрації летких жирних кислот, що продукуються строгими анаеробами. На практиці цей метод використовується рідко із-за високої міри складності і дорожнечі.