6 Раздел Квантовая биофизика и фотофизика биомолекул.

-Условия поглощения света веществом.

ПОГЛОЩЕНИЕ СВЕТА - уменьшение интенсивности оптич. излучения при прохождении через к--л. среду за счёт взаимодействия с ней, в результате к-рого световая энергия переходит в др. виды энергии или в оптич. излучение др. спектрального состава. Осн. законом П. с., связывающим интенсивность I пучка света, прошедшего слой поглощающей среды толщиной l с интенсивностью падающего пучка I0, является закон Бугера Не зависящий от интенсивности света коэф. наз. показателем поглощения, причём как правило, различен для разных длин волн. Этот закон был экспериментально установлен П. Бугером и впоследствии теоретически выведен И. Ламбертом .

Бугера - Ламберта - Бера закон. Физ. смысл его состоит в том, что сам процесс потери фотонов пучка в среде, характеризуемый не зависит от их плотности в световом пучке, т. е. от интенсивности света, и от толщины поглощающего слоя l. Это справедливо при не слишком больших интенсивностях излучения ).

Зависимость от длины волны света называется спектром поглощения вещества. Поглощение твёрдых тел характеризуется, как правило, очень широкими областями (сотни и тысячи нм) с большим значением ;

Спонтанное испускание атомов осцилляторной модели соответствует свободным (затухающим) колебаниям электронов. Собств. частоты этих колебаний vnm задаются 2-м постулатом Бора: где и - уровни энергии атома, между к-рыми совершается квантовый переход с испусканием света на частоте vnm.

При распространении в среде света, падающего на неё извне, колебания электронов в атомах носят вынужденный характер и совершаются с частотой падающей световой волны.

При спец. условиях возбуждения возможна т. н. инверсная населённость, когда т. е. когда населённость верхнего уровня больше населённости нижнего. Поскольку поглощение фотона приводит к переводу атома с нижнего уровня на верхний, то процесс поглощения влияет на заселённость энергетич. уровней.

- Хромофоры в биомолекулах.

Поглощение света осуществляется не всей молекулой, а определенны-

ми ее участками – хромофорами. Хромофоры – это отдельные химические

группы только одного типа атомов в молекуле вещества, поглощающие

кванты света в УФ- и видимой областях спектра. Основными хромофорами

в белках являются пептидные группы, ароматические аминокислоты и цис-

теин. Все они поглощают в УФ-области спектра. В нуклеиновых кислотах

основными хромофорами являются пуриновые и пиримидиновые азотистые

основания нуклеотидов, поглощающие в диапазоне длин волн 255–270 нм.

Хромофорами сложных белков является гем.

- Закономерности поглощения света.

Методы анализа, основанные на поглощении электромагнитного излу-

чения анализируемыми веществами, составляют обширную группу абсорб-

ционных оптических методов (от англ. аbsorbance – поглощаемость). Длины

волн, при которых происходит поглощение, и степень поглощения зависят

от структуры и от окружения макромолекулы, поэтому спектроскопия по-

глощения, или абсорбционная спектроскопия, может служить полезным ин-

струментом для характеристики макромолекул. При поглощении света ато-

мы и молекулы анализируемых веществ переходят в новое возбужденное

состояние. Возбужденная молекула обладает набором дискретных кванто-

ванных энергетических состояний, называемых энергетическими уровнями

молекулы. Световые волны являются плоскопоперечными, они рас-

пространяются перпендикулярно направлению электрического и магнитного

полей

-Законы поглощения электромагнитного излучения веществом, оптическая плотность, спектр поглощения.

Взаимодействие света с веществом описывается рядом законов, основ-

ными из которых являются:

1. Закон Гротгуса–Дрейпера: химически активным является излучение с такими длинами волн, которые поглощаются веществом. Этот закон не имеет исключений.

2. Закон Вант–Гоффа: количество химически модифицированного све-том вещества прямо пропорционально количеству поглощенной веществом энергии света.

3. Закон Бугера–Ламберта-Бера для монохроматического света: однородные слои одного и того же вещества одинаковой толщины поглощают одну и ту же долю падающей на них световой энергии (при постоянной концентрации растворенного вещества). Математически этот закон выражается уравнением экспоненциальной зависимости:

I = Ioe-εcl,

где ε – молярный коэффициент экстинкции (поглощения); с – концентрация вещества (моль/л); l – длина оптического пути (толщина слоя вещества).

Оптическая плотность (D) – это десятичный логарифм отношения интенсивности света, падающего на образец (Io), к интенсивности света, выходящего из образца (I):

D = lg Io/I.

Светопропускание (Т) – отношение интенсивности света, вышедшего из образца, к интенсивности света, падающего на образец:

Т = I/Iо.

Светопоглощение – величина, равная 1 – Т; измеряется в долях или процентах.

Спектр поглощения, или, более корректно, абсолютный спектр поглощения вещества, представляет собой зависимость количества поглощенного света от длины волны.

-Спектрофотометрия, её физические основы.

Спектрофотометрический метод – один из наиболее распространенных методов исследования в биологии. В биологических исследованиях чаще всего используются спектрофотометры (СФ) и фотоэлектроколориметры

(ФЭК). Для выделения участка спектра или отдельных длин волн в спектро-фотометрах используют призмы или дифракционные решетки.

Монохроматор – это оптическая система, выделяющая из всего спектра источника света излучение определенной длины волны.

-Возбужденные состояния биомолекул.

Возбужденные состояния молекул. Колебательные и вращательные возбужденные состояния играют чрезвычайно важную роль в термических химических реакциях ); информацию о строении и свойствах этих состояний дают соответствующие спектры). Реакции, протекающие через высшие колебательные возбужденные состояния, получаемые путем многократного поглощения фотонов одной и той же молекулой, изучает лазерная химия.Электронные возбужденные состояния отличаются от остальных тем, что характеризуют совершенно иное электронное строение молекул и их химические свойства. Эти возбужденные состояния определяют протекание фотохимических, а также некоторых радиационно-химических и плазмохимических реакций. Возбужденные состояния обладающие одновременно избыточной электронной и колебательной энергией, называют вибронными состояниями.

При возбуждении один из электронов переходит с занятой (чаще всего связывающей или несвязывающей) орбитали на одну из свободных (разрыхляющую или вакантную).

В возбужденных состояниях спины неспаренных электронов могут быть как антипараллельными, так и параллельными. В молекулах с четным числом электронов, таким образом, имеется два набора возбужденных состояний, различающихся по мультиплетности, - синглетные и триплетные.

В молекулах с нечетным числом электронов соответственно имеются наборы дублетных и квартетных возбужденных состояний.

Изменение электронной структуры атомов и молекул при переходе из основного в возбужденные состояния приводит к изменению их геометрии.

Электронные возбужденные состояния могут быть стабильными или диссоциативными (нестабильными). Для первых характерно наличие полного минимума на поверхности потенциальной энергии, для вторых - монотонное понижение энергии при увеличении расстояния между какими-либо атомами или атомными группами.

Потенциалы ионизации (первые) молекул и атомов в возбужденных состояниях уменьшаются на величину энергии возбуждения, а сродство к электрону возрастает на ту же величину, Т. обр., при возбуждении возрастают как электронодонорные, так и электроноакцепторные свойства.

Содержащие непарный электрон на несвязывающей орбитали ВОЗБУЖДЕННЫЕ СОСТОЯНИЯ -типа обладают, подобно радикалам, способностью отрывать атомы водорода от других молекул.

Сильное изменение электронного строения и химических свойств молекул и атомов при переходе в возбужденные состояния обусловливает возможность протекания фотохимических реакций.

-Схема Яблонского для сложных молекул.

Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уровней энергии, предложенная Яблонским .

При поглощении кванта света молекулой осуществляется переход с самого нижнего колебательного подуровня основного состояния на возбужденные уровни S1, S2 или Sn.

-Флуоресценция и фосфоресценция.

Одним из способов дезактивации электронно-возбужденного состояния (перехода в исходное) является флуоресценция.

Флуоресценция – это физический внутримолекулярный процесс, в результате которого молекула за время, составляющее 10-8–10-9 с, переходит в основное состояние с испусканием кванта света.

Одним из путей возвращения молекулы в основное состояние является излучательная дезактивация с испусканием фотона. Это явление, как указы-валось выше, называется флуоресценцией

Именно при переходе с уровня S1 на любой колебательно-вращательный подуровень основного состояния S0 и происходит излучение кванта света. В общем случае флуоресценцией называют разрешенный по спину излучательный переход между двумя состояниями одинаковой мультиплетности, а именно, между синглетными уровнями S1→So.Эффективность флуоресценции описывается квантовым выходом флуоресценции – отношением количества излученных квантов к числу поглощенных.

-Законы флуоресценции.

1Спектр флуоресценции относительно спектра поглощения сдвинут в более длинноволновую сторону (закон Стокса).

2 Благодаря процессам внутренней конверсии спектры флуоресценции не зависят

от длины волны возбуждающего света (правило Кашѝ).

-Флуоресцентные зонды, классификация и свойства.

При решении ряда специфических задач, а также при исследовании нефлуоресцирующих

или слабо флуоресцирующих веществ, широко используется метод флуоресцентных зондов (ФЗ).

Флуоресцентным зондом называется флуоресцирующая молекула, которая связывается с биологическими мембранами, белками, другими компонентами клетки нековалентными связями.

Флуоресцентные зонды можно разделить на несколько групп:

1. Флуоресцентные зонды, несущие заряд – положительный (аурамин О) или отрицательный 1-анилинонафталин-8-сульфонат (1,8-АНС), толуидинонафталин сульфонат (ТНС). Эти зонды достаточно гидрофобны, но, благодаря заряду, они могут растворяться в воде.

2. Флуоресцентные зонды, не имеющие заряда, но обладающие значительным дипольным моментом. Эти зонды более гидрофобны.

3. Флуоресцентные зонды, не имеющие заряда и значительного дипольного момента (неполярные). К ним относятся пирен, перилен, дифенил-гексотриен, ретинол.

исследование с помощью ФЗ позволяет отвечать на следующие вопросы:

а) сколько в белке участков, предназначенных для связывания малых

молекул;

б) какова энергия связывания;

в) какова полярность участков связывания;

г) располагаются ли вблизи участков связывания положительные или

отрицательные группы;

д) каковы размеры белковой молекулы;

е) каково расположение белковых молекул

ж) какова толщина липидного бислоя мембраны и др.