Культуральные исследования

Достоверная клиническая интерпретация результатов микробиологического исследования больного достигается только при обязательном соблюдении следующего правила:

Микроскопическое и культуральное исследования должны производиться параллельно только из одной и той же пробы диагностического материала

Процедура посева

Перед процедурой посева необходимо подготовить пробирки с питательными средами, пронумеровать их согласно нумерации анализов и последовательно расположить их в вертикальном штативе. Аналогичным образом необходимо подготовить и пронумеровать предметные стекла.

Осадок, полученный после предпосевной обработки диагностического материала одним из вышеуказанных методов, следует подвергнуть параллельному культуральному и микроскопическому исследованиям

Инкубация

Инкубация микобактерий туберкулеза имеет свои особенности. Они заключаются в том, что микобактерий размножаются чрезвычайно медленно, - время деления микробной клетки составляет 18-24 часа. Это требует длительного срока инкубации (приблизительно 2,5-3 месяца) для получения видимого роста колоний. Длительный срок инкубации диктует необходимость соблюдения рядя правил для сохранения жизнеспособности клеток и ростовых свойств питательной среды.

При первичном посеве бактериоскопически отрицательного материала средняя продолжительность роста микобактерий на питательных средах составляет 20-46 дней. Рост отдельных штаммов появляется через 60 и более дней. Это заставляет при отсутствии роста выдерживать посевы в термостате не менее 2,5-3 месяцев.

В процессе инкубации посевов необходимо соблюдать следующее:

• по истечении 2-3 суток инкубации ватно-марлевые пробки заменяют резиновыми или силиконовыми;

• после этого засеянные пробирки переводят в вертикальное положение;

• инкубирование проводят в течение 2-3 месяцев при обязательном еженедельном просмотре посевов, во время которого отмечают сроки появления роста, его интенсивность и другие параметры.

Питательные среды

Для посева диагностического материала используют разнообразные питательные среды, однако, ни одна из них не обладает качествами, предъявляемыми к ним современной микробиологической диагностикой туберкулеза.

В связи с этим для повышения результативности культурального метода рекомендуется применять посев диагностического материала одновременно на несколько (2-3) питательных сред разного состава.

Существует большое количество плотных питательных сред и разные лаборатории используют различные среды: Левенштейна-Иенсена, Петраньяни, Финна, Мордовского (среда "Новая"), Аникина А-б и А-9, Попеску и др.

В результате многочисленных сравнительных испытаний установлено, что для культуральной диагностики туберкулеза следует использовать среду Левенштейна-Иенсена и Финна-II.

Оценка и учет результатов посева диагностического материала Критерии оценки результатов посева

При оценке результатов культурального исследования диагностического материала необходимо соблюдать следующие правила:

наблюдение за посевами и просмотр засеянных пробирок осуществлять еженедельно;

при еженедельной оценке результатов регистрировать следующие параметры:

• появление роста - срок появления роста, начиная со дня посева;

• интенсивность роста - число выросших колоний;

• загрязнение посева посторонней микрофлорой или грибами;

• отсутствие видимого роста.

Соблюдение этих правил позволяет:

• во-первых, своевременно выявить макроскопический видимый рост микобактерий и загрязняющей микрофлоры;

• во-вторых, на основании изучения сроков появления роста и его особенностей осуществить первичную идентификацию микобактерий.

При этом необходимо учитывать, по крайней мере 3 следующих параметра:

• • появление роста кислотоустойчивых микобактерий в течение 7-10 дней культивирования на плотных яичных средах свидетельствует о выделении быстро растущих нетуберкулезных микобактерий;

• • появление роста кислотоустойчивых микобактерий после 3-4 недель культивирования свидетельствует о выделении микобактерий комплекса М. tuberculosis, а также других медленно растущих микобактерий, которые могут относиться к потенциально патогенным нетуберкулезным микобактериям или к безвредным кислотоустойчивым сапрофитам;

• • прежде, чем дать отрицательный ответ после 2,5-3 месяцев культивирования, необходимо убедиться в отсутствии роста очень медленно растущих микобактерий, в числе которых могут быть и М. tuberculosis.

• • Ответ при культуральном исследовании на микобактерий дается только после микроскопии окрашенного по Цилю-Нильсену мазка из выросших колоний.

Обычно вирулентные культуры микобактерий туберкулеза растут на плотных питательных средах в виде R-колоний, имеют желтоватый (не желтый) или слегка кремовый оттенок (цвет слоновой кости), шероховатую поверхность, напоминающую крошки хлеба или цветную капусту. Колонии, как правило, сухие морщинистые, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розово-желтый пигмент которых легко отличается от оранжевого, желтого пигмента сапрофитных или некоторых нетуберкулезных микобактерий. Последние обычно растут в S-форме. Однако некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (фотохромогенные) могут расти в виде R-колоний.

Следует отметить, что на среде Финна колонии часто выглядят более влажными, чем на среде Левенштейна-Йенсена.

При микроскопическом исследовании мазков выросших колоний окрашенных по Цилю-Нильсену, обнаруживаются ярко-красные палочковидные бактерии, лежащие одиночно или группами, образующие скопления или переплетения в виде "войлока" или "кос". Микобактерии туберкулеза выглядят как тонкие, или слегка изогнутые палочки длиной 1 -10 (чаще 1-4) мкм, шириной 0,2-0,6 мкм, гомогенные или зернистые со слегка закругленными концами. Часто в препарате, особенно у длительно растущих культур, видны скопления темноокрашенных зерен. В молодых культурах, особенно выделенных от длительно леченных больных, микобактерии отличаются большим полиморфизмом, вплоть до наличия коротких, почти кокковидных форм.

Если морфология колоний или палочек вызывает сомнения в их туберкулезной природе, или культуры выделены из материала, который может содержать кислотоустойчивые сапрофиты (моча, гной из ушей и пр.), мазки дополнительно обесцвечивают 3% солянокислым спиртом. Следует учитывать, что молодые культуры микобактериq могут обесцвечиваться солянокислым спиртом, так как они еще слабо кислотоустойчивы. В таких случаях культуры следует выдержать еще 5-10 дней в термостате и вновь повторить микроскопическое исследование, чтобы убедиться в их кислотоустойчивости.

Нетуберкулезные и авирулентные сапрфитные микобактерии обычно морфологически выглядят более грубыми, более толстыми и иногда менее интенсивно окрашенными. Кроме того, из-за отсутствия корд-фактора они, как правило, не образуют жгутообразных скоплений.

Учет результатов посева диагностического материала.

При выделении культуры кислотоустойчивых микобактерии, отвечающих вышеперечисленным характеристикам, а именно:

• • появление роста колоний на плотных питательных средах не ранее 3-4 недель с момента посева и начала инкубации;

• • наличие колоний характерной морфологии и окраски;

• • микроскопическое подтверждение кислотоустойчивости выделенного микроорганизма при окраске по Цилю-Нильсену

следует произвести количественную оценку интенсивности роста. Интенсивность роста микобактерии отмечают по 3-х бальной системе:

• (+) - 1-20 КОЕ на всех пробирках - "скудное" бактериовыделение;

• (++) - 21-100 КОЕ на всех пробирках - "умеренное" бактериовыделение;

• (+++) - >100 КОЕ на всех пробирках - «обильное» бактериовыделение.

Все характеристики выросших на плотных питательных средах микобактерии заносятся в лабораторный журнал учета результатов культуральных исследований, а также в компьютерную базу данных полицевого учета.

Диферециация микобактерии комплекса М.tuberculosis.

Несмотря на то, что предварительное заключение о выделении микобактерии туберкулеза может быть сделано опытным бактериологом на основании вышеперечисленных характерных признаков, обязательным является подтверждение принадлежности выделенной культуры микобактерии к комплексу М.tuberculosis на основании специальных лабораторных тестов.

Для дифференциации микобактерии комплекса М. tuberculosis (М.tuberculosis, M.bovis, M.africanum, M.microti) от других кислотоустойчивых микобактерии необходимо применять следующие основные биохимические тесты:

• • тест на наличие способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест);

• • тест на наличие нитратредуктазы;

• • тест на наличие термостабильной каталазы;

• • тест на наличие способности расти на среде с натрием салициловокислым.

В качестве дополнительных можно использовать также следующие тесты:

• • рост на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты;

• • рост на среде, содержащей 5% хлористого натрия;

Для дифференциации М.tuberculosis humanus отM.bovis используют следующие биохимические пробы:

Таблица 3.

Тесты для дифференциации Mycobacterium tuberculosis complex.

Дифференциальные тесты	Mycobacterium tuberculosis complex
	M.tuberculosis humanus			M.bovis
Основные биохимические тесты на наличие:
Никотиновой кислоты		+		-
Нитратредуктазы		+		-
Термостабильной каталазы		-		-
Рост на среде с 1000 мкг/мл салициловокислого натрия		-		-
Дополнительные тесты: рост на средах, содержащих
500мкг/мл паранитробензойиой кислоты	-		-
5% хлористого натрия	-		-
Тесты для дифференциации M.tuberculosis humanus и M.bovis на наличие:
Никотиновой кислоты	+		-
Нитратредуктазы	+		-
Пиразинамидазы	+		-
Рост на среде с 2 мкг/мл ТСН	+		-

• ниациновый тест;

• тест на наличие нитратредуктазы;

• тест на наличие пиразинамидазы;

• рост на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 карбоксиловой кислоты (ТСН).

В настоящее время разработаны и предлагаются для работы в практических лабораториях молекулярно-биологические методы. Однако, диагностическая информативность должна быть изучена в репрезентативных исследованиях

Микробиологическая диагностика оппортунистических микобактериозов, актиномикоза, нокардиоза.

Введение.

В последние десятилетия атипичные микобактерии привлекают всё большее внимание бактериологов и клиницистов. Растущая роль атипичных микобактерии в патологии человека в определённой степени связана с беспорядочным применением антибиотиков — все атипичные микобактерии характеризуются широким спектром лекарственной устойчивости и потенциальной патогенностью для человека и животных.

Микробиологические исследования отделяемого нижних дыхательных путей. Исследование мокроты и промывных вод бронхов при пневмониях, абсцессах легких и поражениях плевры.

Введение.

Пневмонии относятся к числу наиболее распространенных острых заболеваний. Согласно официальной статистике (Центральный научно-исследовательский институт организации и информатизации здравоохранения МЗ РФ) в 1999 г. в России среди лиц в возрасте ≥ 18 лет было зарегистрировано 440049 случаев внебольничной пневмонии (3,9%_о). Очевидно, однако, что эти цифры не отражают истинной заболеваемости. Так, согласно данным зарубежных эпидемиологических исследований, заболеваемость внебольничной пневмонией у взрослых (> 18 лет) колеблется в широком диапазоне от 1-11,6%₀ у лиц молодого и среднего возраста, до 25-44%₀ в старших возрастных группах (> 65 лет).

В США ежегодно диагностируется 3,000,000 - 4.000,000 случаев внебольничной пневмонии, из которых более 900,000 госпитализируются. Из числа последних непосредственно от внебольничной пневмонии ежегодно умирают более 60,000 человек. В течение года общее число взрослых больных (> 18 лет) внебольничной пневмонией в 5 европейских странах (Великобритания, Франция, Италия, Германия, Испания) превышает 3,000,000 человек.

Заболевание обусловлено комплексом патологических процессов, развивающихся в лёгочной ткани; основное проявление – инфекционное эксудативное, реже межуточное воспаление, вызываемое различными микроорганизмами и доминирующее во всей картине заболевания. С точки зрения патогенеза необходимо чётко дифференцировать первичные и вторичные пневмонии и др. За рубежом основной принцип классификации пневмоний – их этиология; в отечественной практике продолжают разделять пневмонии по тяжести, клинико-морфологическим формам, патогенезу и т.д.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА пневмоний