Техника микроскопического исследования мазка

Окраска люминесцентными красителями.

При обработке микобактерий люминесцентными красителями (аурамин, родамин и др.) они связываются с поверхностными воскоподобными структурами микробной клетки. При облучении окрашенных клеток возбуждающим источником света они начинают светиться оранжевым или яркокрасным светом на черном или темнозеленом фоне. За счет свечения вокруг клетки образуется ореол, благодаря которому видимые размеры светящейся клетки превышают ее физические размеры. В связи с этим, а также в силу высокой контрастности видимого изображения, при исследовании такого мазка можно снизить общее увеличение микроскопа в 4-10 раз, расширить размеры для зрения и уменьшить время, необходимое для просмотра мазка. Наряду с этим, за счет значительно большей резкости и контрастности микроскопической картины повышается комфортность микроскопического исследования, а также расширяются пределы метода. Это делает метод люминесцентной микроскопии особенно ценным при исследовании олигобациллярного материала. Чувствительность люминесцентной микроскопии, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала, приближается к чувствительности метода посева.

Указанные преимущества позволяют использовать люминесцентную микроскопию в лабораториях, выполняющих большое число исследований (порядка 50 и более ежедневно).

При люминесцентной микроскопии используют специальный микроскоп. Источником света служит кварцгалогеновая или ртутная лампа.

Для красителя системы аурамин/родамин используют следующие фильтры: возбуждающий фильтр ФС 1-4, нейтральный фильтр ВС 8-3 и запирающий фильтр СЗС 21-2.

Мазки, окрашенные флюорохромными красителями, просматривают под значительно меньшим увеличением (обычно 250х или 630х), чем увеличение, используемое для просмотра мазков, окрашенных карболовым фуксином (1000х).

Учет результатов микроскопического исследования.

Количество микобактерий, обнаруживаемых при микроскопическом исследовании, является очень важным информационным показателем, так как оно характеризует степень эпидемической опасности больного и тяжесть заболевания. Поэтому микроскопическое исследование должно быть не только качественным, но обязательно и количественным. Используется следующая градация результатов световой иммерсионной микроскопии при использовании объектива 90х или 100х и окуляра 7х-10х (см. таблицу 1).

В силу того, что поле зрения, просматриваемое под люминесцентным микроскопом, имеет значительно большую площадь, чем поле зрения светового микроскопа, в ответе о результатах исследования мазка окрашенного флюорохромами при увеличении в 250 раз, будет содержаться значительно больше микобактерий, чем при исследовании этого же препарата, окрашенного карболовым фуксином.

Таблица1. Градация результатов микроскопического исследования при окраске по Цилю-Нилъсену.

Количество кислотоустойчивых микобактерий	Число иммерсионных полей зрения	Результат
		Качественный	Количественный
МБ отсутствуют	300	Отрицательный	0
1-3	300	Отрицательный	Повторить анализ
От 1 до 9 МБ	100	Положительный	Единичные в препарате с указанием числа МБ
От 10 до 99 МБ	100	Положительный	Единичные в поле зрения (+)
От1 до 10 МБ	1	Положительный	Умеренное количество (++)
Больше 10 МБ	1	Положительный	Значительное количество (+++)

Чтобы уменьшить погрешность в ответах при использовании разных увеличений при исследовании и количественной оценке мазков, окрашенных флюорохромами, количество выявленных кислотоустойчивых микроорганизмов в целях унификации принято делить на "фактор увеличения" (см. таблицу 2).

Таблица 2.

Соотношение результатов микроскопического исследования в зависимости от метода микроскопии и кратности увеличения.

Окраска по Цилю-Нильсену 1000х	Результат	Окраска люминесцентными красителями
		250х	450х	630х
0	МБ не обнаружены	0	0	0
1-9 в 100 п/зрения	Точное число	Разделить полученное число на 10	Разделить полученное число на 4	Разделить полученное число на 2
10-99 в п/зр.	1+
1-10 в 1 п/зр.	2+
>10в 1 п/зр.	3+

Пример: Предположим, что при увеличении в 450 раз было выявлено 20 МБ на 1 поле зрения. Если в соответствии с таблицей, это число разделить на "фактор увеличения", т.е. на 4, соответствующее число бактерий, которое можно увидеть при увеличении в 1000 раз, будет равно 5 в 1 поле зрения. Поэтому при оценке результата следует указать в ответе "2+", а не "3+", как можно было бы оценить по первой колонке таблицы при наличии 20 МБ в 1 поле зрения.

В ответе о результатах микроскопического исследования диагностического материала должен указываться положительный или отрицательный результат микроскопического выявления КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ МИКОБАКТЕРИЙ, но ни в коем случае НЕ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА, так как микроскопическое исследование не позволяет сделать заключение о таксономической принадлежности обнаруженных кислотоустойчивых микроорганизмов к возбудителю туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis) и дифференцировать их от нетуберкулезных микобактерий (возбудителей микобактериозов)

Выделение и идентификация микобактерий туберкулеза культуральными методами.

Достоверный диагноз туберкулеза может быть установлен только с помощью лабораторного исследования при обнаружении микобактерий комплекса М. tuberculosis в диагностическом материале при комплексных микроскопических и культуральных исследованиях.

Метод посева, или культуральный метод выявления микобактерий отличается большей чувствительностью, чем метод микроскопии и имеет перед последним ряд преимуществ. Он позволяет выявлять микобактерий при наличии в исследуемом патологическом материале нескольких десятков жизнеспособных особей возбудителя. Культуральное исследование позволяет увеличивать число выявленных больных туберкулезом на 30-50%, а также поставить диагноз туберкулеза на более ранних стадиях заболевания, когда пациент еще не представляет эпидемически значимой опасности.