Лабораторная диагностика

Бактериоскопическое исследование.

Этот метод исследования является одним из основных и наиболее распространенных. Преимущества его заключаются в простоте, дешевизне и быстроте получения результатов. Однако возможности метода ограничены. В материале можно обнаружить единичные микобактерий, если в 1 мл материала содержится не менее 5000-10000 бактериальных клеток (предел метода).

Приготовление мазков для микроскопического исследования. Существуют два метода микроскопического исследования:

• Метод прямой микроскопии, когда мазок приготавливают непосредственно из необработанного диагностического материала (чаще всего из гнойного комочка нативной мокроты),

• Метод микроскопии мазка из приготовленного для культурального исследования осадка, полученного после специальной предварительной обработки материала детергентами и последующего центрифугирования.

Первый метод широко используется в клинико-диагностических лабораториях (КДЛ) лечебно-профилактических учреждений, в которых производится только микроскопическое исследование материала.

Приготовление мазков для бактериоскопического исследования - это одна из самых опасных процедур, во время которой происходит рассеивание аэрозолей, содержащих возбудитель.

Процедура приготовления мазка из нативного материала.

При приготовлении мазков для прямой микроскопии мокроту переливают в чашку Петри, под дно которой подкладывается черная бумага. Извлеченные из мокроты гнойные комочки с помощью препаровальных игл, бактериологической петли или заостренных деревянных палочек (для каждой порции мокроты - новых) переносят на обезжиренное предметное стекло и равномерно распределяют в центре его на поверхности размером приблизительно 1х2 см.

На одно предметное стекло следует наносить только один мазок

Мазки обработанной для посева мокроты, а также мазки из всех видов жидкого диагностического материала (бронхоальвеолярные смывы, промывные воды бронхов или желудка, моча, пунктаты из закрытых полостей, экссудаты и др.) приготавливают из осадка, полученного после обработки материала детергентами с последующим отмыванием, либо нейтрализацией и центрифугированием.

Все мазки из осадка приготавливают после выполнения процедуры посева.

С помощью пипетки на стекло наносятся 1-2 капли осадка, который распределяется тонким слоем в центре стекла на площади 1 см х 2 см.

Процедура приготовления мазка из осадка:

1. Перед приготовлением мазка осадок нейтрализуют 1-2 каплями 6% соляной кислоты, определяя рН индикаторной полоской (оптимально рН=6,8).

2. Встряхивают.

3. Наносят на предметное стекло 1-2 капли осадка и равномерно распределяют на площади 1 х 2см.

4. Мазок из осадка жидких материалов (моча, промывные воды и пр.) во избежание смывания материала при окраске приготавливают на стеклах, предварительно смазанных яичным белком.

Фиксация мазков.

Приготовленные вышеуказанным способом препараты помещают на 15-30 минут на фильтровальную бумагу для просушивания при комнатной температуре. Не допускается подсушивание сырых мазков над пламенем горелки. Высохшие стекла фиксируют в пламени не больше 3-5 секунд).

Высушенные и фиксированные мазки должны сразу же окрашиваться и ни в коем случае не оставляться открытыми на ночь, что увеличивает опасность распространения инфекции и возможность переноса ее насекомыми.

Методы окраски диагностических мазков.

Для окраски мазков, приготовленных непосредственно из диагностического материала (метод прямой микроскопии), наиболее эффективным является метод Циля-Нильсена. Кислоустойчивые микобактерии по Цилю- Нильсену окрашиваются в ярко-красный цвет, а другие микроорганизмы и клеточные элементы мазка - в голубой. Препарат микроскопируют в световом микроскопе с масляной иммерсией.

Обычные анилиновые красители не воспринимаются микобактериями, и последние не окрашиваются

Окраску люминисцентными красителями рекомендуется применять только при исследовании мазков, приготовленных из осадка материала, обработанного для культурального исследования.

Техника микроскопического исследования мазка:

Для исследования мазков, окрашенных по методу Циля-Нильсена, используют бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом (90х или 100х) и окуляром 7х-10х. ВОЗ рекомендует микроскопировать препарат на протяжении не менее 5 минут, что позволяет просмотреть за это время не менее 300 полей зрения и обнаружить в препарате единичные микобактерии. При значительном количестве кислотоустойчивых микобактерии достаточно исследовать 30-50 полей зрения.

Кислотоустойчивые микобактерии обычно выявляются как тонкие. прямые или изгнутые палочковидные микроорганизмы длиной 1-10 мкм и шириной 0,2-0,6 мкм, окрашенные в ярко-красный цвет. В препарате могут выявляться также измененные формы микобактерии в виде скопления кислотоустойчивых зерен («зернистые формы»), округлых сферических L-трансформированных или ветвистых мицелиеподобных структур.

Окраска для люминесцентной микроскопии.

Мазки для люминесцентной микроскопии следует готовить из осадка материала после обработки детергентом с последующим отмыванием или нейтрализацией и центрифугированием.

Во всех сомнительных случаях для контроля результатов следует использовать повторную микроскопию мазка после покраски его по методу Циля-Нильсена.

Существует несколько методов окраски микобактерии люминесцентными красителями. Наибольшее распространение получили метод окраски аурамином и родамином по Бою, и метод окраски аурамином О

Процедура окраски аурамином и родамином по Бою:

• стекла с фиксированными мазкам раскладывают на специальные штативы ("рельсы"), чтобы они не касались друг друга;

• мазки заливают на 1 час раствором красителя (аурамин О - 1г, родамин С - 0,1 г, дистиллированная вода - 1л;

• в течение 3-5 мин обрабатывают мазки обесцвечивающим раствором (3% солянокислый спирт);

• повторно промывают мазки дистиллированной водой и повторно обесцвечивают;

• гашение фона осуществляют в течение 25-60 сек раствором метиленового синего (0,25г хлорида метиленового синего на 1000 мл дистиллированной воды);

• мазки высушивают при комнатной температуре. Процедура окраски аурамином О:

• стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы ("рельсы") так, чтобы они не касались друг друга;

• мазки заливают на 15 минут раствором аурамина О (аурамин О -0,1г растворяют в 10мл 95% этилового спирта +3,0г кристаллического фенола, растворенного в 87мл дистиллированной воды);

• аккуратно промывают мазки дистиллированной водой;

• в течение 2 минут обесцвечивают 3% раствором солянокислого спирта;

• промывают дистиллированной водой;

• гашение фона осуществляют в течение 2 минут раствором перманганата калия (0,5 г КMnO₄ + 100мл дистиллированной воды) или раствором акридинового оранжевого (0,01 г безводного двухзамещенного фосфата натрия – Na₂HPO₄+ 0,01 г акридинового оранжевого + 100мл дистиллированной воды); при передержке раствора гасителя фона на мазке интенсивность флюоресценции может уменьшаться ;

• мазки промывают дистиллированной водой;

• высушивают при комнатной температуре.

При окраске люминесцентными красителями ни в коем случае нельзя подогревать мазки и пользоваться фильтровальной бумагой

Промывание мазков в процессе окраски следует производить только дистиллированной водой, так как водопроводная вода содержит соединения хлора, которые могут изменять флюоресценцию.

Микроскопию окрашенных мазков производят по возможности сразу же после окончания процедуры высушивания. В случае невозможности проведения немедленной микроскопии окрашенные мазки рекомендуется сохранять в холодильнике желательно не более 1 суток.