Посев исследуемого материала

Питательные среды. Отбирают хлопьевидные включения из пробы гнойной мокроты (или из материала, более всего приближенного к ней) и высевают на различные питательные среды.

Рекомендуемый минимальный набор для культивирования:

1. Кровяная среда с диском оптохина в центре питательной среды.

2. Шоколадный агар с/без селективной добавкой для гемофильной палочки.

3. Агар Мак-Конки/ среда Эндо.

Для проб мокроты, в которой при окрашивании по методу Грама обнаружены:

• грамположительные кокки в форме виноградной грозди -- в набор добавляют чашку с манитол-солевым агаром или желточно-солевым агаром (среда Чистовича).

• грамположительные дрожжеподобные структуры -- добавить в набор среду Сабуро.

• Для выделения культуральным методом легионелл можно использовать специальные селективные дифференциально-диагностические среды – BCYE (максимальное время инкубации для получения отрицательного ответа 14 дней).

• Для выделения культуральным методом микоплазмы, можно использовать специальные селективные дифференциально-диагностические среды PPLO (максимальное время инкубации для получения отрицательного ответа 21 день).

Культивирование

Мокроту выливают в чашку Петри. С помощью стерильных металлических толстых игл с утолщенными концами (типа зубного зонда) выбирают 2—3 гнойных комочка мокроты. С целью очистки комочков мокроты от наслоившихся обитателей верхних дыхательных путей и ротовой полости их трехкратно отмывают в стерильном физиологическом растворе, после чего засевают на питательные среды.

В чашки Петри посев производят стеклянным стерильным шпателем, равномерно растирая материал по поверхности питательной среды. Посевы помещают в термостат при 37° С.

Содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при отсасывании через трахеостому, засевают как мокроту, но без предварительного отмывания гнойных комочков физологическим раствором. При отсутствии комочков гноя и слизи производят посев материала, набирая его пастеровской пипеткой.

Материал из глотки, носа и ротовой полости засевают так же, как мокроту. При наличии соответствующего указания лечащего врача для выделения возбудителей дифтерии, озены, гнойного менингококкового ринита необходимо производить исследование материала, руководствуясь соответствующими приказами.

Посев производят на среды, хранившиеся при комнатной температуре или согретые в термостате. При посеве тампоном материал втирают в среду со всей поверхности тампона на небольшом участке в 1—2 см², а затем штрихами по всей поверхности питательной среды. Посевы помещают в термостат при 37°С.

Посевы исследуемого материала (мокрота, содержимое бронхов) просматривают после 18—24-часовой инкубации при 37° С. Учитывают количество выросших колоний, соотношение отдельных ассоциантов, описывают характер колоний. Выделяют чистые культуры микроорганизмов, проводят их идентификацию и определяют чувствительность к антибактериальным препаратам.

Количественный метод

Мокрота. Берут 1 мл мокроты, добавляют 9 мл питательного бульона или 2% пептонной воды (разведение 1:9, т. е. 10^-1) и гомогенизируют в банке со стеклянными бусами 20 мин. Гомогенизацию можно проводить в ступке, растирая мокроту со стерильным кварцевым песком, добавляя питательный бульон до конечного разведения 1:9. Из полученной эмульсии мокроты (1:9) готовят серийные разведения в бульоне (0,5 мл мокроты + 4,5 мл бульона) до 10^-7, каждый раз меняя пипетки. Посев осуществляют в обратном порядке с большего разведения. Засевают по 0,1мл из разведении мокроты 10^-7, 10^-5, 10^-3, 10^-1 на чашку с кровяным агаром и агаром с гретой кровью. Параллельно посев из указанных разведении на кровяном агаре помещают в эксикатор с горящей свечой. Посев на желточно-солевой агар, среду Эндо и Сабуро делают из исходного разведения 1:9. Инкубируют в течение суток при 37° С. На 2-ые сутки чашки просматривают и подсчитывают каждый вид микроорганизма. Количество микроорганизмов определяют в максимальном разведении мокроты, в котором еще удалось обнаружить данный вид бактерий.

Например. На кровяном агаре выросли 3 колонии пневмококка при посеве 0,1 мл мокроты с разведения 10^-5. Следовательно, в 1 мл мокроты содержится 3Х10 и умноженноe на 10⁵ (степень разведения) =3.000.000 пневмококков 3Х10⁶. Диагностически значимым является обнаружение пневмококка и гемофильной палочки (до антибактериальной терапии) в 1 мл мокроты в концентрации 10⁶ и выше. Аналогичные концентрации значимы для условно-патогенных микроорганизмов в случае 2—3 кратного обнаружения с интервалом 3—5 дней.

Содержимое бронхов.

При количественном подсчете бактерий бронхиальные смывы, представляющие собой гомогенную взвесь, условно принимают за разведение 1:9.(10¹). Диагностически значимым является обнаружение пневмококков и гемофильной палочки (до антибактериальной терапии) в концентрации 10⁴. Аналогичные концентрации значимы и для условно-патогенных микроорганизмов в случае 2—3 кратного обнаружения с интервалом 3—5 дней.

Мазки из гортани и зева. При количественном исследовании тампоны тщательно суспендируют в 1 мл бульона и условно принимают за разведение 1:9.

Дальнейшее исследование этих материалов проводит как количественное определение мокроты.

Оценка результатов.

При воспалительных процессах дыхательных путей, когда высеваются условно-патогенные микроорганизмы, интерпретация полученных результатов представляет определенные трудности. Следует учитывать, что наличие или отсутствие в исследуемом материале микроорганизмов не может иметь решающего значения для диагноза.

Для разделения нормальной симбиотической микрофлоры верхних дыхательных путей (контаминирующей мокроту) от микрофлоры – этиологического агента гнойно-воспалительного процесса – используется целый комплекс тестов..

Следует подчеркнуть достаточную информативность и высокую корреляцию качественного и количественного методов посева при правильном их выполнении.

Особое значение принадлежит количественной оценке роста различных видов микроорганизмов, выросших при первичном посеве на плотных питательных средах. Для ориентировочной оценки количественного роста микроорганизмов и ассоциации целесообразно пользоваться следующими критериями:

I — очень скудный рост — рост единичных колоний (до 10);

II — скудный рост — рост 10—25 колоний,

III — умеренный рост — рост множества сосчитываемых колоний (не менее 50);

IV — обильный рост — сплошной рост несосчитываемых колоний.

III и IV степени роста обычно свидетельствуют об этиологической роли данного микроорганизма, I и II степени — о носительстве или контаминации.

Главным критерием является количественный. С помощью этого метода определяют содержание в мокроте определенного вида микроорганизма, исходя из того, что возбудитель находится в материале в значительно большем количестве, чем микробы – симбионты человека. Количественный метод обеспечивает выделение чистых культур микроорганизмов и дает возможность судить более точно об этиологической значимости выделенных микроорганизмов. Этиологически значимым считают такое количество условно-патогенных бактерий (диагностический титр или "критическое число"), которое не встречается у здоровых людей в данном биотопе и которое способно вызвать заболевание. Для мокроты это число составляет следующие величины: для стрептококка пневмонии - 106 и больше, для стафилококка - 105 и больше, для знтеробактерий - I04 и больше, для кандид - 103 и больше КОЕ/мл материала. Количества на порядок меньшие в случаях доминирования в ассоциации или отсутствия других видов в материале должны быть оценены как возможно этиологически значимые. Для ПВБ диагностически значимым является обнаружение пневмококков и гемофильной палочки (до антибактериальной терапии) в концентрации 104. Аналогичные концентрации значимы и для других условно-патогенных микроорганизмов в случае 2—3 кратного обнаружения с интервалом 3—5 дней.

Определенное значение имеет вид выделенного микроорганизма. Streptococcus gr. viridans, Corynebacterium spp., Neisseria spp., Staphylococcus spp. (кроме возбудителей дифтерии и менингита) составляют нормальную микрофлору носоглотки и ротоглотки, поэтому как возбудителей инфекции их следует учитывать только у имунокомпрометированных пациентов тогда, когда их количество превышает обычное и сохраняется при повторных исследованиях. При неинвазивном методе забора материала для получения достоверного результата немаловажное значение имеет взятие проб мокроты.

О возбудителе необходимо судить на основании комплекса исследований: данных микроскопии первичных мазков, результатов посева нa плотные питательные среды (количественная оценка роста различных видов микроорганизмов, однородность популяции при посеве на плотные питательные среды), учета анамнеза, клинических проявлений заболевания и результатов комплексной терапии.

Серологический метод используют чаще при затяжных и хронических формах. Реакции ставят в динамике. Результаты серологического метода в меньшей степени зависят от этиотропной терапии по сравнению с другими методами. К недостаткам метода относят ретроспективность результатов и сложность получения диагностических препаратов при изучении антителогенеэа.

Перспективным является выявление растворимых видовых и типовых антигенов возбудителя в материале из дыхательных путей, крови с помощью антительных диагностикумов или встречного иммуноэлектрофореза.

Определение чувствительности к антибиотикам

Используют стандартный диско-диффузионный метод, предложенный Керби и Бауэром (метод Керби – Бауэра). В качестве примера приводим рекомендуемый набор дисков с антибиотиками и критерии учета полученных результатов для стафилококков (табл. 1, 2). Средой для постановки теста на чувствительность является среда Мюллера – Хинтона с добавлением 4 – 5% NaCl.

Таблица 1. Набор дисков с антибактериальными препаратами и диаметр зон ингибирования роста для определения чувствительности штаммов стафилококка при отрицательном результате определения бета-лактамаз

Антибактериальный препарат	Диск/ концентрация	Диаметр ингибирования зон
		R	I	S
Оксациллин	ОХ/1	<10	11-12	>13
Бензилпенициллин	P/1O	<28	-	>29
Ампициллин	AM/10	<28	-	>29
Цефазолин	CZ/30	<14	15-17	>18
Примечание. Здесь и в табл. 2: R - устойчивые; I - промежуточные; S - чувствительные.

Таблица 2. Набор дисков с антибактериальными препаратами и диаметр зон ингибирования роста для определения чувствительности штаммов стафилококка при положительном результате определения бета-лактамаз

Антибактериальный препарат	Диск/ концентрация	Диаметр ингибирования зон
		R	I	S
Оксациллин	ОХ/1	<10	11-12	>13
Эритромицин	E/15	<13	14-22	>23
Клиндамицин	CM/2	<14	15-20	>21
Ко-тримоксазол	CXT	<10	11-15	>16
Фузидиевая кислота	FA/10	<15	16-21	>22
Ванкомицин	VA/30	-	-	>15
Амоксициллин/клавуланат	AmC/30	<19	-	>20
Цефуроксим	CXM/30	<14	15-22	>23

Для определения чувствительности стафилококков предварительно проводят определение наличия/отсутствия у тестируемого штамма ферментов, получивших название "бета-лактамаз" – диск с нитроцефином (BBL, США). При отсутствии данных ферментов используют диски. При наличии у тестируемого штамма данных ферментов необходимо использовать диски, представленные в табл.2. Предлагаемый подход к тестированию чувствительности штаммов стафилококка важен для правильной интерпретации полученных результатов чувствительности:

1. При отсутствии бета-лактамазообразования и сохранении чувствительности к оксациллину препаратами выбора являются природные аминопенициллины и цефалоспорины I поколения.

2. При наличии бета-лактамазообразования и сохранении чувствительности к оксациллину препаратами выбора являются оксациллин, защищенные пенициллины, цефалоспорины II поколения.

3. При наличии бета-лактамазообразования и отсутствии чувствительности к оксациллину бета-лактамные антибиотики (включая карбапенемы) являются клинически не эффективными. Применяются препараты других групп.

Стрептококки (в том числе пневмококк). Для этих микроорганизмов метод

Керби – Бауэра имеет свои ограничения:

1. Он корректен лишь для пневмококка. И только в том случае, если тот показывает чувствительность к оксациллину (нагрузка 1 мкг). В случае снижения чувствительности к оксациллину необходимо использовать метод Е-теста или серийных разведений.

2. При использовании метода Керби – Бауэра для тестирования стрептококков в среду Мюллера – Хинтона необходимо добавлять 5% бараньей крови/эритроцитов.

3. Стрептококки группы "viridans" не рекомендуется тестировать на чувствительность к антибиотикам этим методом из-за отсутствия воспроизводимых результатов.

Псевдомонады и другие неферментирующие грамотрицательные бактерии. Ограничения диско-диффузионного метода:

1. Стандартизован лишь для синегнойной палочки и бактерий рода Аcinetobacter.

2. При исследовании чувствительности других псевдомонад и неферментирующих грамотрицательных бактерий необходимо использовать Е-тест или метод серийных разведений.

Гемофильные палочки.

Ограничения диско-диффузионного метода:

1. Для постановки чувствительности диско-диффузионным методом должна использоваться специальная среда – HTM (Haemophilus Test Medium).

Дрожжеподобные грибы рода Кандида и др

Ограничения диско-диффузионного метода:

1. Используется специальные среды – казитоновый агар и полусинтетический агар для тестирования грибов.

2. Более достоверные результаты получаются при использовании метода серийных разведений.

Таким образом, резюмируя сказанное, можно сделать следующие выводы:

• При определении чувствительности к антибактериальным препаратам штаммов энтеробактерий и стафилококков рекомендуется использовать метод Керби – Бауэра.

При определении чувствительности к антибактериальным препаратам штаммов стрептококков (в том числе пневмококка), неферментирующих грамотрицательных палочек, гемофильных палочек и дрожжеподобных грибов рекомендуется использовать коммерческие тест-системы ("стрипы"), представляющие собой набор тех или иных антибиотиков, представленных в двух концентрациях. Это метод (breakpoint) позволяет избежать трудоемкости стандартного метода серийных разведений, но не теряет при этом его главного достоинства – количественного определения минимальной подавляющей концентрации препарата, соответствующей терапевтической концентрации антибиотика в организме.

При установлении пневмококковой этиологии инфекций дыхательных путей антибиотиками выбора для лечения могут быть: пенициллин, эритромицин, ко-тримаксозол. При необходимости замены могут быть использованы: цефалоспорины III, амоксициллин, тетрациклин, офлоксацин, клиндамицин, хлорамфеникол, рифампин.

При выделении S.pyogenes из нестерильных локусов необходимо применять в первую очередь эритромицин. Антибиотиками второго ряда являются клиндамицин, тетрациклин, хлорамфеникол, офлоксацин, пенициллин.

Стафлококковая этиология предполагает выбор из следующего минимального набора антибиотиков: оксацилин, линкомицин, эритромицин, ко-тримоксазол, рифампицин, ванкомицин.

Антибиотики для H.influenzae из нестерильных локусов: ампицилин, ампицилин/сульбактам, ко-тримоксазол.

Для лечения инфекций, вызванных синегнойной палочкой, препаратами первого ряда для определения чувствительности являются цефтазидим, уреидопенициллины, аминогликозиды (гентамицин), ципрофлоксацин, карбоксипенициллины (карбенициллин). Препаратами второга ряда (дополнительными) служат амикацин, цефоперазон, цефепим, меропенем, имипенем/циластатин, а для Acinetobacter – сульперазон. Для доугих видов неферментирующих бактерий, и особенно редко встречающихся, оценка АБ-резистентности требует индивидуальных подходов.

Отдельно подчеркиваем особенности микробиологической диагностики легионелл, микоплазм и хламидий.

• Легионеллезы в настоящее время микробиологически диагностируются с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ) на определение антигена.

• Первичная атипичная пневмония (микоплазменная) также микробиологически подтверждается с помощью ИФА выявление антител (IgG , IgM).

• Хламидийные пневмонии диагностируются микробиологически как РИФ, так и ИФА (антигены и антитела (IgG)).