Микробиологическая диагностика пищевых токсикоинфекций, интоксикаций, инфекций. Особенности преаналитического этапа.

К специфическим инфекциям относят брюшной тиф, паратиф А и В, другие сальмонеллезы, дизентерии, бруцеллез, лептоспироз, вирусные гепатиты, полиомиелит и другие вирусные инфекции, амебиаз, балантидиаз, гельминтозы. К этой группе ОКЗ, вероятно, следует также отнести кишечный иерсиниоз и колиэнтерит, вызванный энтеропатогенными кишечными палочками.

Оппортунистнческие ОКЗ вызываются Еscherichia coli, Citrobacter freundii, Klesiella pneumoniae, Serratia marcesens, Hafnia alvei, Arizona, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Campilobacter jejuni, Staphylocoocus aiureus. Streptococcus faecalis, Bacillus cereus.

Микробиологическая диагностика. Для постановки этиологического диагноза оппортунистических ОКЗ используют, главным образом, бактериологический метод. При хронических и затяжных формах в сыворотке больного нередко выявляют нарастание антител к доминирующей аутокультуре.

Материалом для исследования служат испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, пищевые продукты и сырье, с которыми связывают развитие болезни. Материал должен быть исследован в первые часы после забора, при отсутствии такой возможности, его помещают в консервант (фосфатно-глицериновую смесь или другие).

Исследование на условно-патогенные микробы часто производят после того, как из материала не удается выделять облигатно-патогенных возбудителей. Однако целесообразно, а при остром токсико-энтеральном начале обязательно надо вести параллельное исследование на условно-патогенные бактерии.

Материал засевают на дифференциально-диагностические среды, позволяющие наряду с облигатно-патогенными выделить условно-патогенные микробы. Испражнения, рвотные массы, продукты в количестве около I г суспензируют в 10 мл 0,5% раствора хлорида натрия, встряхивают, отстаивают 15 минут и надосадочную жидкость засевают на дифференциально-диагностические среды для облигатно-патогенных возбудителей ОКЗ. Для выделения условно-патогенных бактерий разведения материала, как указано в обобщенной схеме, засевают на чашки со средами Левина (Эндо) - для выделения энтеробактерий, ЖСА (для стафилококков), МПА с фурагином (для псевдомонад), щелочной агар (для вибрионов). МПА (для бацилл), среду Китта-Тароцци (для клостридий).

Выделяют чистые культуры, проводят их идентификацию, определяют чувствительность к антибиотикам, определяют факторы патогенности.

Оценка этиологической роли выделенных культур проводится на основании соответствия перечисленным выше критериям. Главным из них является количественный. Этиологически значимой для отсутствующих или присутствующих в небольшом количестве в кишечнике здоровых людей видов является величина 10⁶ КОЕ в г(мл) материала и больше. При выделении кишечной палочки, которая в кишечнике у здоровых людей находится в очень больших количествах, нужны дополнительные критерии. При заболеваниях, протекающих по типу пищевого отравления, диагноз становится более достоверным при обнаружении такой же культуры в пищевом продукте и у группы лиц, его принимавших. В случаях выделения условно-патогенного микроба в этиологически значимых количествах наряду с облигатно-патогенным следует думать о сопутствующем дисбактериозе или вторичной оппортунистической инфекции, осложнившей течение основного заболевания.

Лабораторная диагностика сальмонеллезных гастроэнтеритов.

1.Забор материала.

а. Испражнения исследуют с первых дней заболевания и до выписки больного из cтационара: в первый раз — до начала антибактериальной терапии, в последующем — после окончания (не ранее 48 ч). Вероятность выделения сальмонелл из испражнений наибольшая на 1 нед заболевания, на 2 и 3 нед она снижается в 2-6,7 раза соответственно. При гастроинтестинальной форме возбудителя чаще выделяют из испражнений преимущественно на 1 нед. При патологических примесях в испражнениях (слизь, кровь, гнои и т.п.) их включают в отбираемую пробу.

б. Рвотные массы и промывные воды желудка забирают в объёме до 100мл. Для исследования используют первые порции промывных вод, полученные без применения дезинфицирующих средств. При кислых значениях рН рвотных масс перед посевом их нейтрализуют 10% раствором бикарбоната натрия, промывные воды центрифугируют 15 мин при 3 000 об/мин и в дальнейшем используют осадок. В случае невозможности центрифугирования допускают посев нативного материала.

в. Жёлчь (дуоденальное содержимое) отбирают в стерильные пробирки. При этом отдельно собирают дуоденальное содержимое, пузырную жёлчь и жёлчь из жёлчных протоков (порции А, В и С). Кислая среда, белесоватый оттенок, хлопья делают материал непригодным для бактериологического исследования.

г. Моча. Забирают после тщательного туалета наружных половых органов; первую порцию отбрасывают, остальную в количестве 20-30 мл собирают в стерильную посуду. Мочу центрифугируют 15 мин при 3 000 об/мин, для исследования используют осадок. Однако допускают высев и нативного материала. С наибольшей частотой сальмонеллы в моче обнаруживают на 2-3 нед заболевания.

д.Спинномозговая жидкость.

Исследуют при менингеальном или менингоэнцефалитическом синдроме. Пробу (3-5 мл) помещают в стерильную пробирку и доставляют в, лабораторию, предохраняя материал от замораживания (можно использовать термос). К. Дополнительные материалы для исследования — биоптаты костного мозга (0,5-0,75 мл засевают на среду обогащения), мокрота (гнойные комочки засевают на среду Плоскирева и КА), розеолы (скарифицируют, наносят 1-2 капли жёлчного бульона, отсасывают и засевают на жёлчный бульон), молоко кормящих матерей. При необходимости (при оперативных вмешательствах или летальном исходе) для исследования отбирают операционный и секционный материал. Масса пробы должна быть не менее 20 г.

Забор смывов с оборудования и других объектов окружающей среды проводят стерильными ватными или ватно-марлевыми тампонами. Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют средой обогащения (забуференная пептонная вода с рН 7,0), наклоняя пробирку; излишек влаги отжимают о стенку пробирки. Смывы берут с площади не менее 100 см2, если нет специальных указаний для данного объекта. При взятии смывов с яичной скорлупы один тампон используют для исследования 10 яиц.

2. Посев на питательные среды

а. Среды. В качестве сред обогащения используют селенитовый бульон с аминопептидом селенитовую и магниевую среду, тетратионатовый бульон Мюллера, среду Кауффмана 20% жёлчный бульон. Среди дифференциально-диагностических сред для первичных посевов материала и высевов со сред обогащения выделяют высокоселективные (например, висмут-сульфитный агар или агар с бриллиантовым зелёным), среднеселективные (среда Плоскирева, слабощелочной питательный агар) и низкоселективные (агар Эндо и Левина}. На средах для первичной идентификации (агар Клиглера, комбинированная среда по Олькеницкому, среда Ресселя) определяют ферментацию лактозы (на среде Олькеницкого — и сахарозы), глюкозы, способность образовывать сероводород и газ, гидролиз мочевины. Для биохимической идентификации используют среду с мочевиной по Кристенсену, среду с мочевиной по Преусу, среду Кларка, среды с углеводами, среди для определения индолообразования, среды с аминокислотами (лизином, орнитином, аргинином), глицериново-фуксиновый бульон Штерна и полужидкий агар для определения подвижности.

б. Подозрительные колонии (не менее трёх) пересевают в пробирки со скошенной или одной из комбинированных сред (Олькеницкого, Клиглера, Ресселя). В случае эпидемической вспышки из подозрительных колоний (параллельно с пересевом на комбинированную среду) проводят высев на МПА для последующей постановки реакции агглютинации. Результаты этой реакции требуют подтверждения на этапе завершения биохимической идентификации. Одновременно изучают морфологию и тинкториальные свойства бактерий, готовя мазки и окрашивая их по Граму. При отсутствии подозрительных колоний чашки с висмут-сульфитным агаром оставляют в термостате еще на 24 ч, после чего просматривают и при обнаружении подозрительных колоний продолжают исследования. В противном случае работу с посевами прекращают. Возбудитель паратифа В может давать сплошной слизистый рост или феномен валообразования (образование слизистого валика по периметру колоний).

в. Для дальнейшей работы отбирают колонии, уреазаотрицательных бактерий, ферментирующих глюкозу, не ферментирующих сахарозу и образующих H2S. Культуры, пересеянные со среды Олькеницкого в среду Хисса с маннитом, 1 % пептонную воду для определения образования индола и в полужидкий агар для определения подвижности. При выделении культур, имеющих ферментативные свойства, характерные для сальмонелл, изучают антигенную структуру в реакции агглютинации на стекле с О - и Н-агглютинирующими диагностическими антисыворотками, а также определяют биовары. По результатам реакции агглютинации ставят окончательный бактериологический диагноз, а исследование прекращают.

г. В последнее время широко распространились дифференциально-селективные ксилозо-лизин-деоксихолатные (XLD-агар) среды для сальмонелл и шигелл (SS-агар); выросшие на них колонии сальмонелл красные с чёрным центром (за счёт образования H2S). Однако эти среды не более селективны, чем висмут-сульфитный агар или агар с бриллиантовым зелёным.

3. Серологические исследования проводят для диагностики, а также выявления и дифференциации различных форм носительства

Микробиологическая диагностика оппортунистических заболеваний мочевыводящей системы

Введение.

Исследование мочи направлено на выделение возбудителя заболевания и на количественное определение степени бактериурии. Моча здорового человека стерильна, однако может содержать микроорганизмы, попадающие туда из дистального отдела уретры или влагалища. В их число входят коагулазоотрицательные стафилококки, коринобактерии, колиформные бактерии (энтерококки, лактобактерии, стрептококки, гемолитические и другие). Для большинства этих бактерий моча является хорошей питательной средой, при попадании в которую они быстро размножаются. Поэтому для определения наличия инфекции следует дифференцировать истинную бактериурию, развивающуюся вследствие заболевания, от контаминации мочи.

Возбудителями воспалительных процессов в мочевой системе наиболее часто являются условно патогенные грамотрицательные бактерии: (Escherichia coli, Proteus spp,, Citrobacter,Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia marcescens spp.), Pseudomonas aeruginosa. Несколько реже встречаются коагулазоположительные и отрицательные стафилококки, микоплазмы, грибы. Представители рода Salmonella и семейства Мусоbacteriaceae также могут быть выделены из мочи при заболеваниях мочевой системы.

Взятие исследуемого материала

Исследованию подлежит средняя порция свободно выпущенной мочи, взятой в количестве 3—5 мл в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Катетеризация мочевого пузыря для рутинного исследования не применяется, так как она может привести к инфицированию мочевых путей. К катетеризации мочевого пузыря прибегают в некоторых случаях для уточнения локализации инфекции — в мочевом пузыре или в почках. С этой целью мочевой пузырь опорожняют катетером и промывают раствором антибиотика, после чего с интервалом в 10 минут берут пробы мочи для исследования. Если инфекция локализуется в почках, микроорганизмы содержатся во всех порциях мочи. При инфекции мочевого пузыря моча остается стерильной.

Для получения мочи можно использовать метод надлобковой пункции. При этом устраняется контаминация мочи микрофлорой из нижних отделов мочевого тракта и влагалища, облегчается определение инфекции нижних отделов уринарного тракта. Однако, имеется опасность инфицирования больного и поэтому к надлобковой пункции мочевого пузыря прибегают только в случаях необходимости.

Материал для исследования следует брать до начала антибактериальной терапии или в интервалах между курсами лечения.

Содержащиеся в моче микробы быстро размножаются при комнатной температуре, что может дать ложные результаты при определении степени бактериурии. В связи с этим, от момента взятия пробы мочи до начала ее исследования в лаборатории должно проходить не более 1—2 часов при хранении при комнатной температуре и не более 18 часов — при хранении в холодильнике.

Посев исследуемого материала

Питательные среды: питательный агар; 2.5% кровяной агар; сахарный бульон, дифференциально-диагностические среды для энтеробактерий.

Выделение микроорганизмов из мочи не позволяет дифференцировать бактериурию, возникающую в результате загрязнения мочи нормальной микрофлорой дистального отдела уретры, от бактериурии, развивающейся при инфекционных процессах в мочевыводящей системе, возбудителями которых являются условно-патогенные микроорганизмы. С этой целью применяют количественные методы исследования, основанные на определении числа микробных клеток в 1 мл мочи (степень бактериурии). Для определения степени бактериурии используют несколько методов: метод серийных разведении мочи и метод секторных посевов.

Метод секторных посевов. Платиновой петлёй производят посев мочи (30-40 штрихов) на сектор А чашки Петри с простым питательным агаром. После этого петлю прожигают и производят 4 штриховых посева из сектора А в сектор І и аналогичным образом – из сектора І во ІІ и из ІІ в ІІІ. Чашки инкубируют при 37°С 18-24 часа, после чего подсчитывают число колоний, выросших в разных секторах.

Одновременно с подсчетом количества колоний, выросших на чашке Петри, можно выделить чистую культуру возбудителя, идентифицировать ее и определить чувствительность к антимикробным препаратам.

Определение степени бактериурии по количеству выделенных колоний производят по таблице.

А	Количество колоний в секторах			Количество бактерий в 1 мл мочи
	І	ІІ	ІІІ
1-6	-	-	-	менее1000
8-20	-	-	-	3000
20-30	-	-	-	5000
30-60	-	-	-	10000
70-80	-	-	-	50000
100-150	5-10	-	-	100000
не сосчитать	20-30	-	-	500000
-//-	40-60	-	-	1 млн.
-//-	100-140	10-20	-	5 млн.
-//-	не сосчитать	30-40	-	10 млн.
-//-	-//-	60-80	ед. колонии	100 млн.

Метод серийных разведении мочи заключается в посевах определенного количества различных разведении мочи на плотные питательные среды и последующего подсчета числа выросших колоний в 1 мл неразведенной мочи. Метод достаточно точен, но требует большой затраты питательных сред, лабораторной посуды и времени.

Ускоренные методы основаны на определении продуктов метаболизма, образующихся при размножении микроорганизмов в моче. Они дают менее точные результаты, чем метод секторальных посевов, и чаще используются при массовых профилактических обследованиях больших контингентов людей, для экспресс диагностики. При использовании ускоренных методов лаборатория дает предварительный ответ через день после получения результатов и окончательный через 4 дня после выделения чистой культуры микроорганизмов, их идентификации и определения чувствительности к антибактериальноым препаратам.

Нитритный тест. Нитриты, являющиеся продуктами метаболизма представителей семейства Enterobacteriaceae, могут быть обнаружены в моче с помощью реактива Грисса. Для этого смешивают приготовленные растворы с 1 мл мочи. Появление красного окрашивания свидетельствует о присутствии в 1 мл мочи не менее 10⁵ микробных клеток.

Эффективность метода может быть значительно повышена добавлением в мочу нитратов с последующей инкубацией при 37 °С в течение 2—4 часов перед постановкой нитритного теста.

ТТХ-тест. Трифенилтетразолий хлористый (ТТХ) под действием продуктов жизнедеятельности микроорганизмов переходит из бесцветного в красный нерастворимый в воде трифенилформазан. Интенсивность окраски находится в прямой зависимости от степени бактериурии.

Готовят три раствора: 1. Насыщенный раствор двузамещённого фосфорнокислого натрия; 2. 750 мг ТТХ растворяют в 100 мл раствора 1; 3. Рабочий раствор — 4 мл раствора 1 смешивают со 100 мл раствора 2. Хранят растворы в прохладном защищенном от света месте. Срок хранения растворов 1 и 2 — до 2-х месяцев, рабочего раствора — не более 2-х недель.

При постановке реакции пользуются стерильной посудой.

К 2 мл мочи прибавляют 0,5 мл рабочего раствора и помещают после перемешивания в термостат при 37°С. После 4 х часовой инкубации учитывают результаты. Появление на дне пробирки красного осадка свидетельствует о наличии в 1 мл мочи не менее 10⁵ микробных клеток.