12. Технології рекомбінантних днк. Які типи векторів використовуються в генній інженерії? Яким критеріям повинна відповідати кільцева молекула днк, щоб бути плазмідним вектором ?

Рекомбінантна ДНК — штучно створена людиною послідовність ДНК, частини якої можуть бути синтезовані хімічним шляхом, за допомогою ПЛР, або клоновані з ДНК різних організмів. Рекомбінантні ДНК можуть бути трансформовані в клітини живих організмів у складі плазмід або вірусних векторів. Генетично модифіковані тварини і рослини зазвичай містять рекомбінантні гени, вбудовані в їхні хромосоми.

Прокаріотичні вектори

- Плазмідні вектори.

- Фагові вектори.

- Косміди.

- Фазміди.

- Штучні хромосоми та подібні вектори

Для еукаріотичних клітин використовують:

-віруси;

-плазміди;

-транспозони;

-агробактерії;

-штучні хромосоми.

Щоб бути плаз мідним вектором молекула ДНК має відповідати наступним вимогам:

• бути репліконом ;

• нести селективний маркер;

• нести зручні сайти рестрикції для

клонування.

13. Описати основні типи систем експресії. Проблеми, які виникають при бактеріальній експресії білків та способи їх вирішення.

Системи експресії діляться на два основні типи:

- бактеріальні;

- еукаріотичні(ділять на дріжджові, в клітинах комах, ссавців та в рослинних клітинах).

В прокаріотичних системах експресії використовують, як вектори: фаги(лямбда, мю), плазміди, фазміди, косміди, транспозони. Як клітини-хазяїни найбільш широко використовуються E.coli, бо вони найкраще досліждженні, ал ще викоритсовують B.subtillis, та інші. Проте бактеріальні системи експресії мають ряд недоліків(наряду з рядом переваг): не мають сплайсингу, ендоплазматичного ретикулуму, систем посттрансляційних модифікацій: фосфорилювання, глікозилювання, меристилювання чи пальмітування, неефективність транскрипції і/або трансляції, нестабільність білка в цитоплазмі, токсичність білка, утворення агрегатів білка, нестабільність штама-продуцента. Відповідно, є висока імовірність отримання некоректно укладеного та нефункціонального білка. Чим більше пострансляційних модифікацій має містити білок тим менш раціональним є використання прокаріотичних систем експресії.

Вирішення проблем, які виникають при використанні бактеріальних систем експресії:

1) Нестабільність білкового продукту в цитоплазмі хазяїна - використання для експресії штамів, дефектних по протеазам lon і omp, дозволяє значно знизити протеолітичну деградацію експресованого білка.

2) Утворення тілець включення - зниження температури культивування після індукції, зменшення кількості індуктора, зміна штаму-реципієнта, експресія злитого з тіоредоксином білка, використання штамів, дефектних по

тіоредоксинредуктазі, додавання сигналу периплазматичної локалізації, коекспресія молекулярних шаперонів, додавання солей металів, використання штаму AD494.

3)Потреба в пострансляційних модифікаціях – використання еукаріотичних систем експресії.

14. Методи ідентифікації та виділення рекомбінантних білків.

1)Гель-електрофорез та імунохімічні методи ідентифікації продуктів експресії: вестерн-блот аналіз, дот-блот аналіз, блотинг колоній, імунопреципітація, імуноферментний аналіз.

2) Ідентифікація білкових продуктів експресії з використанням властивостей експресованого продукту та константної ділянки гібридних білків.

3) Методи очистки рекомбінантних білків, що грунтуються на властивостях експресованого білка та константної ділянки гібридних білків (хроматографія, імунохроматографія, та ін.)

Гель-електрофорез фракцій лізату до та після індукції – кількість білку після індукції має бути значно більшою аніж фракція лізату до індукції. Також використовується центрифугування для відділення клітинного лізату. З наступною більш тонкою очисткою.

Також білки модна ідентифікувати за їх активністю, якщо це, наприклад, фермент.