1.Основні характеристики структури подвійної спіралі ДНК. Які взаємодії стабілізують подвійну спіраль? Роль іонів у стабілізації структури ДНК.  

Подвійна структура ДНк має в середньому: ширину 2нм та 3,4нм довжини на 10 нуклеотидних пар, що є повним витком. Утворює малий жолобок та великий жолобок. Стабілізація подвійної спіралі: комплементарні водневі зв*язки відіграють головнку роль у стабілізації подвійної спіралі; стекінг взаємодії; гідрофобний ефект; Ван-дер-Вальсові взаємодії; полі катіони, які нейтралізують фосфатні групи – і зтягують віддалені нуклеотиди. Іони,А саме катіони потрібні для нейтралізації заряду з фосфатних груп – і протягування віддалених нуклеотидів( долають енергію відштовхування).

2.Описати всі структурні форми подвійних спіралей нуклеїнових кислот ДНК і РНК.

Чи може РНК перейти в В-форму і чому? 

Структурні форми ДНК:

В-форма(10 пар нуклеотидів на виток спіралі, конформація дезоксирибози С2-ендо).

А-форма(11 пар нуклеотдиві на один виток). Конформація дезоксирибози на С3-ендо.

Відбувається при знижені полярності розчинника та при підвищенні концентрації солі. Найлегше GG/CC, найважче AA/TT. Перехід з В- форми проходить майже одночасно.

С-форма ДНК – р-х з високою іонною силою, наприклад, 3М натрій хлор. Перехід в В форми повільніший ніж в А. Йде більша компактизація (9.3 нуклеотидних пар на виток). Пари основ мають певний нахил до осі спіралі. Poly(dA)poly(dT)-10 н.о. на виток утворює B’-форма. Висока конфірмаційна жорсткості, і до вигину теж.

d-форма – схожа на С-форму Poly(dAdT).

Z-форма – має свою назву через те, що зв*язок фосфодиефірний має зигзагоподібну форму. Poly(dGdC). Це ліва спіраль і містить вона 12 залишків на один виток, кут нахилу нуклеотиів 60 градусів. Також мають особливості стекінг взаємодії.

Х-форма – особлива форма ДНК, характерна для паліндром них послідовностей.

Н-форма – потрійна спіраль poly(dA)poly(dT) з poly(dT).

G4 квадруплексна форма – GGTTAG - на кінцях.

Для РНК характрені А та А’ спіралі. Вони не утворює подвійних спіралей між собою(міжмолекулярних), але може утворювати спіралі з ДНК, також утворює внутрішньомолекулярні структури.

РНК не може перейти в В-форму, бо вона не може утворити конформацію цукристої сонови С3-ендо.

3.Охарактеризувати банки даних біологічних послідовностей. 

NCBI(National Center of biotechnology information). Містить базу даних від ДНК послідовностей до 3Д структури білків. Ресурс містить багато різноманітної інформації.

PDB –банк містить данні про структуру білків. Амінокислотну послідовність і до 4ї структури.

NDB Atlas

Бази містять послідовності ДНК, РНК, амінокислотні. Містять інформацію про локалізацію генів у хромосомах.

Та інші.

4.Принцип секвенування ДНК “за Сенгером”. 

Проводяться чотири окремі реакції кожна з яких мітить один з дидезоксирибонуклеотид трифосфатів(ddA, ddT, ddG, ddC), також вони містять 4 нормальних дидезоксинуклеотид триофсфата. ДНК-полімеразу та праймери,які мають мічений радіактивною міткою нуклеотид. Синтез послідовності обривається на місці де включається дидезоксинуклеоти, бо він не може утворювати 2 фосфодиефірні зв*язки. Потім проби з 4х пробірок розганяють на 4х дорожках в ППАГ з додецилсульфатом натрія. Та зчитують обернену послідовність. Метод трудомісткий.

5.Які амінокислотні залишки мають тенденцію до формування α-спіралей, які – до β-структур і які є характерними для ділянок з невпорядкованою структурою? 

До α-спіралей – аланін, пролін, метіонін, лейцин. Для до β-структур ізолейцин, валін, триптофан, лейцин, метіонін, цистеїн, фенілаланін, триптофан. Для невпорядкованих характерні гліцин і пролін.

6.Як формується пептидна группа в білках? Які властивості має пептидна група?

Пептидна група формується при конденсації амінокислот за рахунок з*єднання карбоксильної та аміногрупи – проходить з відщепленням води. Петидна група має дві резонансні форми, що стабілізують її. Також пептидна група може бути гідролізованна водою, але ця реакція йде слабо. Зарахунок резонансних структур може утворюватись значний дипольний момент, який відіграє значну роль в утворенні альфа-спіралей.

7.Типи і основні характеристики вторинних структур, у глобулярних білках. Які взаємодії стабілізують вторинну структуру? 

Типи: альфа-спіраль, 310-спіраль, бета-шар(паралельний та антипаралельний), бета-вип*ячуваня, бета-поворот. Альфа спіраль виникає внаслідок закручення поліпептидного ланцюга вправо. на 1 виток припадає 3.6 залишків. Карбонільний кисень 1-го залишка формує водневий зв’язок з амідним протоном 4-го залишка.

В альфа-спіралях, за винятком початку спіралі немає проліну, тому що будова його молекули заважає нормальній укладці спіралі. Альфа спіраль є більшості білках. В бета-листі, який складається з паралельних бета-стрендів, гідрофобні залишки розподілені на обох сторонах листа, а в бета-листі який складається з антипаралельних бета-стрендів гідрофобні залишки локалізовані тільки на одній стороні листа.

Бета-лист – утворюється взаємодією внутрішньомолекулярної або міжмолекулярної.

8. Що таке карти Рамачандрана?

Так як у полінуклеотидному ланцюзі обертання можливе лише навколо двох зв*язків приєднаних до зв*язків С-альфа атому: між С-альфа і карбонільною групою – кут псі та обертання навколо С-альфа – NH – кут фі. Якщо ми будемо знаи ці кути для всіх амінокислотних залишків – ми зможемо побудувати структуру білку. Ці кути найбільш імовірні в згорнутому стані. Зазвичай для білків на картах Рамачандрана(або точніше Рамачандрана-Сосисекхорана) в чорних зонах показані абороненін області, які термодинаміноно невигідні, в сірих напружені, а в білих – дозволені. Якщо якась амінокислота находиться в напруженій зоні – це може бути зумовлене її оточенням. Верхній лівий кут дає величини для бета-листа , в середині діаграми та зліва – величини для a-спіралей

9. Основні взаємодії, які обумовлюють укладку поліпептидного ланцюга у компактну глобулу? 

Компактна глобула виникає, як третинна струткруа білків. Третинна структура – це просторова структура білку, яка утворюється внаслідок взаємодії елементів вторинної та супервторинної структури. Третинна структура зазвичай стабілізується формуванням гідрофобного ядра, водневих зв*язків, солевих мітків, інших типів іонних взаємодій, дисульфід низ зв*язків між цистеїнами. Важливу роль відіграють Ван-дер-Вальсові. Скаладаєтся з структурних мотивів та доменів. Мотиви- поєдання вторинних елементів. Домени – дещо більші елементи, характеризуються більшою стабільністю. Часто домени виконують окрему функцію.

10.Експериментальні методи дослідження просторової структури білків. 

Рентгеноструктурний аналіз, ЯМР, круговий дихроїзм, ІЧ-спектроскопія, ПМР, Масспектроскопія. Та комбіновані методи. Набільш широко використовуваний

рентгеноструктурний. Але не всі білки утворюють кристали за рахунок того, що мають значні неструктуровані ділянки(30%). А також неможливо дослідити динаміку білку. Тому найбільш перспективним методом аналізу білку є ЯМР спектроскопія, яка може досліджувати білок у розчинні. ЯМР білків знімають на 4Д спектрах на ядрах протонів, дейтерію, С13 та Азоту 15. Ізотопи вводять до білку вирощуючи експресуючі агенти на мінімальних середовищах, які як єдине джерело азоту, вуглецю - мають ізотоні сполуки.

11. Метод моделювання просторової структури білків за гомологією. Веб-інструменти та засоби аналізу.  

Для моделювання просторової структури за гомологією використовуються FASTA і BLAST алгоритми. Вони за ситемою пошуку амінокислотних послідовностей знаходять подібні для вже відомих структур. Пошку ведеться за алгоритмами локально, гломабльного та псевдо глобального вирівнювання. Вносяться штрафи за розходження в структурах. Для заміни полярної кислоти на полярну менший, а для неполярної на полярну більший. Так за допомогою комп*ютерного аналізу можна знайти орієнтовну структуру білку. Є на ExPasy.

12. Типи четвертинної структури білків. Яку четвертинну структуру мають IgG та АТФаза? 

Четвертинна структура білку – це структура сформована окремими молекул білків або поліпептидних ланцюжків. Складається, як правило, з парної кількості субодиниць, які окремо не активні. Молекулярна вага субодиниць від кількох тисяч до 100 000.

IgG – має структуру, що складаться з тертрамера. Двох важких ланцюгів і двох легких ланцюгів. Важкі ланцюги з*єднуються між собою дисульфід ними зв*язками, а до них прикріпленні легкі ланцюги також дисульфід ними зв*язками. Утворюється Y-подібна структура. АТФаза також складається з двох субодиниць, тренасмембранної та глікопротеїда.

13. Будова активних центрів ферментів. Активиний центр фермента – ділянка яка відповідає за за зв*язування та каталітичні перетворення субтсрата. Активний центр, це як правило відкритий утвір, що має визначену форму по якій йде зв*язування з субстратом(ключ-замок). В активному центрі є абсорбційний центр – групи, які віповідають за зв*зування білку;та каталітичний центр – групи, які безпосереднь приймають участь у реакції.Активний центр формується з фрагментiв полiпептидного ланцюга.В цих фрагментах є різні амінокислоти, якi мiстять рiзноманiтнi функцiональнi групи. В структурi фермента групи активного центру фiксованi на вiдстанi, оптимальній для взаємодii з субстратом. В формуваннi активного центру приймають участь молекули води, iони металiв та органiчнi кофактори. Жорсткiсть конструкцiї активного центру надають альфа-спiралi, бета-структурнi дiлянки та дисульфiднi зв'язки.

14.Три основні причини прискорення ферментативних реакцій ферментами. 

1)Вільна енергія сорбції субстрату.

2)Поліфункціональністю хімічної взаємодії фермент-субстрат.

3)Мікросередовищем в області активного центру.

15.Теорія індукованої відповідності Кошланда.

Суть теорії індукованої відповідності Кошланда полягаю у тому, що структура активних центрів білків не жорстка, а може змінювати свою конформацію при приєднанні до неї субстрату. Зміни можуть відбуватись не тільки в активному центрі, а й з самим субстаротом. Після досягнення такої конформації бічні амінокислотні групи займають таке положення в якому можуть виконувати каталітичні функції. Ця модель пояснює не тільки специфічність, а й стабілізацію переідного стану.

16.Біоінформатичний аналіз послідовностей білків за допомогою серверів Internet. Які характеристики білка дозволяє отримати сервер ProtParam? 

ЗА допомогою серверів Internet можна проаналізувати міру структурованості нашого білку(DisEmble), розчинність(SolProt), вторинну структуру, можна знайти філогенетично спорідненні білки, основні фізико-хімічні властивості білків і т.д. За допомогою ProtParam можна знайти брутто формулу білку, його точну молекулярну масу, вміст амінокислот, ізоелектричну точку, коефіцієнт екстнції. Кількість позитивних і негативних амінокислот. Час на півжиття білку та індекс нестабільності і аліфатичний індекс.

17.Принципи згортання (фолдинга) білків. Парадокс Левінталя.

Просторова будова білка визначається його просторовою будовою. Білкові глобули утворюються у білків які містять 50-300 амінокилот. При кількості амінкислот більше 300 важко згорнутись у глобулу. Фолдинг білка відбувається не хаотичним пошуком енергетично вигідних конформацій, а детермінованим шляхом, бо хаотичний пошук зайняв би 1.6*10^27с. Folding pathways може відбуватись різними шляхами, проходячи різні енергетичні бар*єри „воронки фолдинга”.

18. Що таке "розплавлена глобула" білків? Якими експериментальними методами можна зареєструвати формування "розплавленої глобули" в білках? При слабких денатуруючи умовах відбувається руйнування глобули, але збереження вторинної структури білку. Розплавленна глобула не містить лементів третинної структури. Гідрофобні амінокислотні залишки злипаються між собою, щоб витіснити воду – гідрофобний колапс. Експерементально утворення розплавленної глобули можна зареєструвати за допомогою ЯМР-спектроскопії, а також методами флюорисцентної спектроскопії, якщо при утворенні розплавленої глобули – змінюється коефіцієнт екстинції(внаслідок зняття екрануваня з відповідних амінокислотних груп).

19.Молекулярні шаперони, їх типи, будова та роль у фолдингу білків. Як використовується вільна енергія гідролізу АТР для виконання роботи молекулярними шаперонами? 

Більшість білків може згортатись без асистування інших білків. А окремі білки можуть не досягати нативних станів. Їх стабілізують молекулярні шаперони, які асистують у холдингу білку. Зв*язування проходить шляхом зв*язування гідрофобних залишків, що призводить до міжмолекулярних взаємодій та перешкоджає неправильному холдингу. Існують різні типи молекулярних шаперонів:формують агрегати, допомагають в транспорті, сприяють холдингу білків, здійснюють рефолдинг, транслокують через мембрану. Багато шаперонів відомі, як білки теплового шоку. Наприклад Hsp60 та Hsp70.

. Зв’язування синтезованих поліпептидів і їх стабілізація проходить

шляхом зв’язування гідрофобних амінокислотних залишків. Iнакше ці гідрофобні залишки будуть асоціювати з іншими гідрофобними зилишками, що буде приводити до міжмолекулярних взаємодій з іншими білками та перешкоджати правильному фолдингу.

Існують різні типи молекулярних шаперонів: деякі сприяють формуванню агрегатів, деякі допомагають в транспорті білків в клітині, інші сприяють фолдингу білків, здійснюють рефолдинг білків, які транслокуються через мембрану, зв’язують та проводять рефолдинг білків , які денатурувались під дією зовнішніх стресів, багато шаперонів відомі як білки теплового шоку.

Приклади молекулярних шаперонів: Yeast Ssc1, Hsp 60 /GroEL, Нsp70.

20. Що таке полімеразна ланцюгова реакція? Чому в ПЛР використовують термофільні ДНК-полімерази? Полімеразна ланцюгова реакція – це реакція збільшення кількості копій ДНК(або ампліфікація)), яки проходить у пристуності 4х дезосирибонулклеотидтрифлсфатів, ДНК – полімерази термостабільної,виділеної з археїв(Taq та інші), які живуть в гарячих джерелах( є кілька видів, які різнять по максимуму температури, репаративному апарату, та швидкості), а такж праймери і ДНК матрицю, яку потрібно копіювати. На першому етапі проводять денатурацію подвійної спіралі ДНК, на другому йде приєднання праймерів(отжиг), потім приєднується ДНК-полімера – йде синтез подвійного ланцюга. Далі йде денатурація – і подальша ампліфікація ДНК. Так як ДНК денатурує при 95граусах цельсія – то звичайні ДНК полімерази руйнуються за таких температур, а термостабільні ДНКполімерази зберігають свою структуру і функції. Зараз ПЛР проводяться в автоматичних апаратах. Загалом ПЛР проводять біля 20 циклів. Кількість копій сягає 2 в степені, яка рівна кількості проведених циклів. Більша кількість циклів не використовується, бо з*являється значна кількість молекул ДНК з помилками.

Модульна контрольна робота №2 з молекулярної біології

1. Рівні структурної організації хроматину.

Хроматин має два рівні організації. На першому ДНК з білками формує нуклеосоми. Білковий компонент нуклеосоми (кор.) складається з корових гістонів - по 2 молекули: Н2А, Н2В, Н3, Н4 (всього 8 молекул). На другому рівні утворюється фібрила за участю лінкерних гістонів Н1. Хроматинова фібрила формує петлі, а кінці жорстко закріплені на скелетних структурах ядерного матриксу.

2. Структурна організація нуклеосоми. Фізико-хімічні властивості гістонів та їх роль в структурі нуклеосоми. Роль гістона Н1.

Нуклеосома – октамер пістонів (Н2А-Н2В-Н3-Н4)₂ + 145 пар основ ДНК (взаємодія за рахунок своєрідного трека позитивно заряджених амінокислот на глобулярній поверхні октамеру). N-кінцеві хвости гістонів Н3 та Н2В виходять за межі нуклеосоми через канали, сформовані маленькими жолобками двох дуплексів сусідніх витків нуклеосомної суперспіралі. N-кінцеві хвости гістонів Н4 та Н2А також взаємодіють з маленьким жолобком зовні нуклеосомної суперспіралі.

Електростатичні взаємодії між ДНК і гістонами є дуже міцними, тому їх зв’язування за фізіологічних умов є необоротним. Контакт між сусідніми витками нуклеосомної суперспіралі призводить до виникнення високої густини негативного заряду, що дестабілізує нуклеосому ДНК і веде до тимчасового часткового розкручування нуклеосомної ДНК на кінцях. За рахунок наявності проміжних акцепторів стає можливим обмін димерами Н2А-Н2В. Міцність ДНК-гістонових взаємодій не дає спонтанно зсуватися нуклеосомі вздовж ДНК, тому виникає потреба в особливих АТР-залежних молекулярних пристроях, яке здійснюють таке ре позиціонування.

Одна молекула Н1 взаємодіє з кожною нуклеосомою хроматину. Н1 наближує нуклеосоми у складі фібрили одна до одної, що сприяє «зшиванню» нуклеусом. Присутність Н1 значно стабілізує фібрилу.

3. Як впливають на функціональний стан хроматину специфічні модифікації гістонів?

Основні типи пост трансляційних модифікацій гістоновихх хвостів:

• ацетилування – в результаті зникає позитивний заряд на залишку лізину.

• метилування (лізин, аргінін) – стабільна у часі модифікація.

• Фосфорилювання (серін).

Гіперацильовані пістони присутні в активних ділянках хроматину. Метилювання одного залишку може викликати репресію транскрипції, іншого (через кілька амінокислот від першого) – супроводжувати активацію; фосфорилювання корелює з активацією транскрипції та супроводжує гуперконденсацію хроматину при переході до мітозу. Головний вплив – специфічне впізнавання модифікованих хвостів іншими білками: регуляторами, факторами транскрипції, ферментами тощо.

4. Мозаїчна будова генів еукаріотів. Дати визначення екзонів і інтронів.

Характерною ознакою генів еукаріотів є мозаїчна будова кодуючої частини. Кодуюча частина – це послідовність окремих змістовних ділянок – екзотів, розділених беззмістовними нітронами. Часто екзони відповідають окремим структурним доменам мультидоменних білків: збирання білка з кубиків-доменів може здійснюватись шляхом перетасування екзонів на рівні ДНК. Беззмістовними інтрони є тому, що не містять інформації про кінцевий продукт, але в межах інтронів часто розташовані важливі регуляторні ділянки. При транскрипції молекула РНК синтезується суцільно (первинний продукт транскрипції - первинний транскрипт - містить екзони та інтрони).

5. Напівконсервативний механізм реплікації.

Кожна молекула ДНК складається з одного ланцюга початкової батьківської молекули і одного ново синтезованого ланцюга. Такий механізм реплікації називаєтьсяя напівконсервативним.

6. Як здійснюється ініціація реплікації у бактерій?

Оріджин oriC – сайт ініціації реплікації – ділянка, що містить 4 сайти по 9 пар основ кожний, що мають спорідненість до білка DnaA, а також кілька АТ-збагачених ділянок по 13 пар основ зі зниженою стабільністю подвійної спіралі. Передумова ініціації є створення за рахунок активності гір ази негативної надспіралізації у циркулярній хромосомі.

7. Що таке праймосома?

Праймосома – комплекс праймази (білок DnaG E. coli) та реплікативної вилки гелікази.

8. Яка точність впізнавання ДНК-полімеразою комплементарної пари нуклеотидів перед здійсненням каталізу синтезу ДНК? Яка загальна точність процесу реплікації ДНК і за рахунок чого вона досягається?

Активний центр ДНК-полімерази впізнає комплементарну пару нуклеотидів перед здійсненням каталізу синтезу ДНК, що забезпечує частоту помилкового включення нуклеотидів на рівні ~10^-5.

В результаті осциляції ДНК-полімерази з перемиканням активності між двома центрами рівень помилок знижується до ~10^-8

9. Яка частота спонтанних мутацій в соматичних та зародкових клітинах людини на 1 генерацію клітин і за рахунок чого досягається низький рівень помилок?

Спонтанні мутації виникають спонтанно протягом всього життя організму в нормальних для нього умовах навколишнього середовища з частотою близько 10^-9 – 10^-12 на нуклеотид за клітинну генерацію.

Оцінка спонтанних мутацій як в соматичних, так і в зародкових клітинах людини складає 1,4*10^-10 мутацій/пару основ/генерацію клітин.

У результаті осциляції полімерази з перемиканням активності між двома центрами рівень помилок знижується до ~10^-8. Остаточний рівень помилок знижується до ~10^-10 за рахунок активності систем репарації.

10. Що таке транскриптом? Які ферменти здійснюють процес транскрипції?

Яка точність транскрипції?

Транскриптом – безпосередній продукт активності геному, сукупність транскриптів.

ДНК-залежна РНК-полімераза. РНК-полімераза складу ααββ’σ називається holo-фермент, складу ααββ’-core-фермент.

Точність транскрипції, що здійснюється РНК-полімеразами, нижче здійснюваної ДНК-полімеразами. Частота помилок: 10^-3-10^-6, тобто 1 з 1000-1000000 нуклеотид не комплементарний матриці.

11. Із яких стадій складається транскрипція? Коротко описати етапи.

1) ініціація: формування закритого комплексу → плавлення подвійної спіралі, утворення відкритого комплексу → включення перших двох нуклеотидів до молекули РНК → зростання первинного короткого транс крипту

2) елонгація: у кожному елементарному акті відбувається приєднання чергового нуклеотиду до 3’-кінця РНК і пересування кор.-ферменту на один нуклеотид уздовж матриці

3) термінація – визволення транскрипту; кор.-фермент знову взаємодіє з ϭ-субодиницею і здійснює новий пошук промотора.

12. Будова РНК-полімерази E.coli. Яка функціональна роль окремих субодиниць РНК-полімерази E.coli?

РНК-полімераза складається з холофермента та корфермента.

σ – змінний фактор специфічності, який дисоціює після ініціації транскрипції. Елонгація і термі нація здійснюється кор.-ферментом. У E.coli близько 10 видів σ-субодиниць. Всі субодиниці заряджені негативно. У кожній субодиниці є кластер (+)заряджених ділянок, якими вони зв’язуються з ДНК. β’ бере участь у зв’язуванні ферменту з ДНК, відповідає за міцне зв’язування з ДНК за рахунок кластера (+)заряджених амінокислот; β містить два активні центри, які відповідають за ініціацію та елонгацію, один працює в холо- інший в кор.-ферменті; α забезпечує правильну взаємодію ферменту з промоторами. Впізнання і зв’язування РНК-полімерази з промотором здійснюється холо-ферментом.

13. Механізми ініціації, елонгації і термінації транскрипції у бактерій.

Зв’язування РНК-полімерази за допомогою α-субодиниця і σ-фактор. Після зв’язування з ДНК структура РНК-полімерази перетворюється із закритої у відкриту. Це перетворення включає в себе поділ моно спіралей ДНК з утворенням розкрученого ділянки довжиною близько 13 кроків. Рибонуклеотиди збираються в ланцюжок відповідно до базової ДНК.

Елонгація: додавання рибонуклеотидів до ланцюга і перехід від структури РНК-полімеразного комплексу від відкритого до транскрипційного. Ділянка ДНК перед РНК-полімеразою розкручується далі, 13-парний комплекс перетворюється на 17-парний. σ-фактор відділяється від РНК-полімерази, що дозволяє комплексу рух вперед. РНК-полімераза зупиняється зупиняється і виправляє помилки у випадках помилкового формування пар основ ДНК-РНК.

Транскрипція: ро-залежний механізм, при якому ро дестабілізує водневі зв’язки між матрицею ДНК і мРНК, вивільняючи молекулу РНК. Ро-незалежний, при якому транскрипція зупиняється, коли тільки що синтезована молекула РНК формує стебло-петлю, за якою розташовано кілька урацилів, що призводить до від’єднання молекули РНК від матриці ДНК. РНК-полімераза II зв’язується з 3’-кінцем промоторної ділянки. Послідовність, забезпечує це зв’язування, так званий ТАТА-бокс, короткий А- і Т-збагачений ділянку, послідовність якого злегка варіює в різних генів. Для взаємодії полімерази з цією ділянкою необхідно кілька білків, основних факторів транскрипції. Полімераза припиняє транскрипцію і дисоціює від ДНК.

14. Що таке енхансер?

Енхансер – коротка ділянка ДНК до якої можуть приєднуватися фактори транскрипції, для збільшення рівня транскрипції гена або оперона.

15. Що таке репарація? Які ферменти приймають участь в репарації?

Репарація – біологічний процес, спрямований на виправлення помилок синтезу ДНК, які виникають під дією різних хімічних та фізичних факторів (хімічні модифікації азотистих основ, ковалентні зшивки піримідинів під впливом УФ, розриви під дією іонізації тощо). Часто працює під час або одразу після реплікації.

Більшість репараційних процесів передбачає видалення пошкодженої одно ланцюгової ділянки з наступним синтезом ДНК за допомогою ДНК-полімераз. Деякі процеси пов’язані з безпосереднім виправленням пошкодженого елементу за рахунок прямої дії деяких ферментів. Пряма репарація: зшивання одно ланцюгового розриву ДНК-лігазою. Тимінові димери, індуковані УФ, руйнуються фотолігазою. Репарація при алкілуванні азотистих основ можлива за рахунок метилтрансфераз. При ексцизійній репарації вирізається пошкоджена ділянка,для цього процесу викорстовуються: глікозилаза, ендонуклеаза, полімераза.

16. Механізми сплайсинга рРНК.

Рибозими, їх будова і функції.

Сплайсинг деяких пре-рРНК відбувається авто каталітично. У цьому випадку каталізатор процесу – інтронна послідовність, що видаляється (рибозим). Реакція відбувається у присутності Mg²⁺ і гуанозинового кофактору (ініціює вивільнення інтрона, з’єднання екзотів, циклізацію інтрона). Для сплайсингу пре-рРНК запропонований двухетапний механізм. Обидва етапи відбуваються шляхом трансестерифікації, обміну фосфатних естерів. 3’-гідрооксильна група вільної молекули гуанозину діє як нуклеофіл. Ця реакція звільняє гідроксильну групу на кінці 5’-кінцевого екзону, яка потім працює як нуклеофіл для другої реакції трансестерифікації.

Молекули РНК, які мають каталітичну активність називають рибозимами. Служать каталізаторами при розщепленні і зшиванні інших молекул РНК. Рибозим має активний центр та два основні домени РНК. Рибосома є рибозимом.

17. Які відомі класи мобільних елементів в геномах організмів і яку важливу роль відіграють ці елементи?

Мобільні елементи геному — послідовності ДНК, здатні переміщатися усередині геному живих організмів. Існує декілька класів мобільних елементів геному, що відрізняються за будовою і способом переміщення:

Інсерційні елементи (короткі ділянки ДНК, що діють як прості мобільні генетичні елементи. IS-елементи мають дві головні характеристики: вони менші за решту типів мобільних генетичних елементів та кодують лише білки, залучені в процес транспозиції (на відміну від транспозонів, що зазвичай несуть допоміжні гени, корисні для організму-хазяїна, такі як гени резистентності). Цими білками зазвичай є транспозаза, яка каталізує процес транспозиції даного IS-елементу, і регуряторний білок, що стимулює або інгібує цю активність. По боках кодуючої ділянки IS-елементу зазвичай розташовуються інвертовані повтори)

Транспозони — послідовності ДНК, що можуть переміщатися в межах геному однієї клітини за допомогою процесу транспозиції. В результаті цього процесу вони можуть викликати мутації і змінювати кількість ДНК в геномі. Транспозони також відомі під назвою «стрибаючі гени».

Профаги — латентна форма помірних бактеріофагів

Плазміди — молекула ДНК, окрема від хромосомної ДНК та здатна до автономної реплікації. Вона звичайно кругла і дволанцюгова. Плазміди в природі частіше за все зустрічаються у бактерій і архей, іноді в еукаріотів (наприклад, гриб Дріжджів пивних). У одній клітині може бути від однієї копії (особливо для великих плазмід) до кількох сотень або навіть тисяч копій тієї ж плазміди (особливо для певних штучних плазмід, сконструйованих для отримання високого числа копій).

Хоча мобільні елементи в цілому є «генетичними паразитами», викликаючи мутації в генетичному матеріалі організму хазяїна, і знижуючи його пристосованість за рахунок витрати ресурсів на реплікацію і синтез білків паразиту, вони є важливим механізмом мінливості і обміну генетичним матеріалом між організмами як одного виду, так і різних видів.

18. Що таке мікроарей-технології і який принцип роботи мікроареїв?

Мікроарей-аналіз є новим напрямком біологічних досліджень, орієнтованим на інтегральне вивчення експресії геному. Його основою є широкий комплекс методів, які дозволяють виділяти, детектувати, ідентифікувати та кількісно аналізувати експресію десятків тисяч генів, що складають транскриптом клітини. Важливу роль у встановленні сучасних мікроарей-технологій відіграло завершення проекту „Геном людини" та супутніх проектів з модельних організмів. Наявність розшифрованих геномів значно полегшило процедуру пошуку та анотації нових генів (як лабораторними, так і біоінформатичними методами), що привело до значного удосконалення технологій виробництва мікроареїв. Доступність анотованих генів також покращила процес виготовлення мішеней під час проектування мікроареїв.

Мікроарей являє собою скляний чи полімерний слайд, на який вибірково наносяться молекули ДНК (або мішені). На мікроарей-поверхню можуть наноситися будь-які молекули (наприклад білки), але оскільки понад 90% сучасних мікроарей-технологій базуються на ДНК, розглядаються лише ДНК- мікроареї під загальним терміном „мікроареї".

Мікроареї "Affymetrix GeneChips" називають чіпами тому, що для виробництва їх застосовують технології фотолітографії, подібні технологіям створення комп'ютерних чіпів.

Мікроареї складаються з окремих так званих плям (в біоінформатиці їх називають ознаками), кожна з яких містить унікальну молекулу кДНК або синтетичний олігонуклеотид.

Виділена із двох типів клітин мРНК зворотньо транскрибується у кДНК, яка мітиться різними барвниками та наноситься на скляний мікроарей слайд. На слайді знаходяться ДНК-мішені, що являють собою кДНК транскрипти генів певного геному, ковалентно приєднані до скляного субстрату. Унікальна кДНК знаходиться в окремій плямі на мікроарей-поверхні. Після гібридизації залежно від інтенсивності того чи іншого барвника визначається, в якій із клітин експресія певних генів вища і на який саме фактор.

Типовий мікроарей-експеримент починається з гібридизації мічених флуоресцентними барвниками молекул ДНК (проб), одержаних зворотньою полімеразною ланцюговою реакцією, виділеної з клітин мРНК, до мішеней на мікроарей-поверхні.

На наступному етапі використовуються сканери й фотоімеджери для детекції інтенсивності флуоресценції з кожної плями. Оскільки її рівень залежить від комплементарності молекул ДНК та кількості проб, отримані кількісні показники інтенсивності використовуються для визначення відносного, а для деяких типів мікроареїв і абсолютного вмісту проб у досліджуваному матеріалі. У більшості випадків кожна пляма на мікроарей-поверхні містить ДНК окремого гена, отже, інтенсивність плями можна інтерпретувати як рівень генної експресії.

19. Протеом - дати визначення. Експериментальні методи протеоміки.

Протеом — сукупність всіх білків клітини, тканини, організму або популяції, що експресуються за певними, чітко визначеними умовами. Термін «протеом» складається з частин слів «протеїни» (білки) та «геном».

Більшість учених, залучених в протеомні дослідження схильні до використання методу іонізації лазерною десорбцією в матриці з часоплинним мас-аналізатором, використовуваного у поєднанні з двовимірним гель-електрофорезом. Проте, практика використання вказує на те, що з'єднання ВЕЖХ з тандемним мас-спектрометром дозволяє набагато ефективніше проводити розділення білків і пептидів, яке особливо корисно для ідентифікації білків і для характеризації їх модифікацій післятрансляцій.

Мас-спектрометрія з використанням іонних пасток володіє глобальними перевагами в протеоміці. Вона здатна ефективно збирати іони і виконувати високоінформативну фрагментацію. Побудований на основі іонної пастки мас-аналізатор, краще всього для швидкої секвенації білків. Можливість прискорювати ідентифікацію і характеризацію білків є надзвичайно важливою.

20. Що таке системна біологія?

Повне або часткове визначення послідовностей геномів великого числа організмів відкрило новий напрям в біологічних дослідженнях, метою якого є вихід на системний рівень аналізу біологічних процесів. Завданням цього нового підходу, є аналіз закономірностей реалізації генетичної інформації на рівні макромолекулярних мереж, з трактуванням відповіді клітини або організму на впливи на молекулярному рівні.

Для створення моделей клітинної регуляції і метаболічних механізмів прагне інтегрувати дані, отримані за допомогою різних високопродуктивних технологій, таких як секвенування генома, ДНК-мікроарей- технології, метод SAGE, SNP-генотипування, скринінг РНКі, дріжджові двогібридні системи, іммунопреципітація хроматину, протеоміка, мас-спектроскопія та використання методів біоінформатики.

Системна біологія потенційно здатна створити модель, в яку можуть бути також інтегровані дані традиційних досліджень окремих генів чи білків і які будуть давати додаткову інформацію до даних високотехнологічних методів.

Модульна контрольна робота №3

з молекулярної біології