83. Иммуноферментный и радиоиммунный анализ: сущность, условия, направления, способы постановки и учета, диагностическое значение.

Иммуноферментный анализ. Один из наиболее распростра­ненных в практике методов — иммуноферментный анализ (ИФА) — основан на использовании двух разных по специфич­ности моноклональных антител против двух разных антиген­ных эпитопов в составе искомого антигена. В лунки с иммо­билизованными антителами против одного эпитопа добавляют материал, в котором ищут антиген. В процессе инкубации на твердой фазе образуется комплекс антиген—антитело. Затем лунки отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела против другого эпитопа того же антигена. После повторной инкубации и отмывания от избыт­ка конъюгата антител с ферментом определяют количество свя­завшихся антител по их ферментативной активности в присутст­вии субстрата с индикатором. При этом величина активности фермента пропорциональна концентрации исследуемого антиге­на. На стадии выявления иммунного комплекса антиген оказы­вается как бы зажатым между молекулами иммобилизированных и меченых антител, что послужило поводом для широко рас­пространенного в литературе названия "сэндвич"-метод.

Повышение специфичности и чувствительности иммуно- ферментного анализа, так же как и иммунофлюоресцентного и радиоиммунного методов, связано с использованием моно- клональных антител (МКАТ).

Для получения МКАТ мышей иммунизируют очищенным препаратом антигена, затем выделяют лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов и проводят слияние их с миеломными клетками-партнерами. Неслившиеся миеломные клетки поги­бают, так как они дефектны по синтезу некоторых нуклеотидов и не могут выжить на селективной среде без этих нуклеотидов. Неслившиеся лимфоциты погибают в культуре из-за отсутст­вия в среде необходимых им трофических факторов. Выживают только гибридные клетки (гибридомы), унаследовавшие от миеломных клеток способность к пролиферации в культуре, а от лимфоцитов — способность к синтезу антител соответствую­щей специфичности. Надосадочную жидкость культур гибри­дом исследуют с помощью ИФА с соответствующим антиге­ном. После выявления клеток, секретирующих нужные анти­тела, их клонируют методом лимитирующих разведений, т.е. клетки разводят таким образом, чтобы получить дочернюю культуру из одной клетки. Тогда все потомство будет генети­чески идентично: одна клетка дает один клон, который проду­цирует МКАТ.

Радиоиммунный анализ. Радиоиммунный анализ (РИА) является чрезвычайно чувствительным методом, который мо­жет быть использован для количественного определения лю­бого антигена. Чувствительность метода позволяет выявлять незначительные количества антигена.

Для проведения жидкостного радиоиммунного анализа очи­щенный известный антиген метят радионуклидами, чаще всего ¹²⁵1. В этом случае используют конкурентный вариант связы­вания, когда для определения количества антигена в исследу­емом образце оценивают его способность конкурировать с меченым референс-антигеном в связывании со специфическими антителами. Образующиеся комплексы антиген—антитело выде­ляют осаждением (сульфатом аммония или антиантителами) и определяют их радиоактивность в сопоставлении с радиоактив­ностью несвязанного антигена в надосадочной жидкости. Ис­пользование ряда концентраций немеченого антигена позволяет построить стандартную калибровочную кривую, с помощью которой определяется концентрация исследуемого антигена.

Более современный метод — твердофазный РИА, при кото­ром специфические антитела фиксируются на твердой фазе, к ним добавляется исследуемый антиген, а затем меченый стан­дартный антиген. Определение связанной и несвязанной метки позволяет построить калибровочную кривую и определить ко­личество исследуемого антигена.

РИА широко применяют для количественного определения различных веществ: гормонов (инсулина, гормона роста, адренокортикотропного гормона, трийодтиронина, тироксина, эст­рогена), белков сыворотки крови (IgE, а-фетопротеина и др.), метаболитов (фолиевой кислоты, циклических нуклеотидов и др.), лекарственных препаратов (дигоксина, дигитоксина, мор­фина), микробных антигенов (HBsAg).