20. Основные принципы выделения чистых культур внутриклеточных паразитов, культивируемых на живых объектах. Этапы выделения чистых культур. Методы индикации вирусов.

Для культивирования облигатных внутриклеточных паразитов (риккетсии, хламидии, вирусы) используют живые объекты – клеточные культуры, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Клеточные культуры подразделяют на неперевиваемые (клетки эпителиальной или соединительной ткани в питательной среде), полуперевиваемые (диплоидные клетки человека) и перевиваемые (в основном опухолевые клетки – постоянное существование in vitro).

Куриные эмбрионы используют в возрасте 8 – 12 дней, они устойчивы к различным воздействиям. При заражении лабораторных животных недостатком является необходимость последующего заражения клеточной культуры для получения чистой линии.

Методы индикации вирусов:

• гибель или заболевание живой системы

• цитопатическое действие

•  реакция гемадсорбции («зонтик» - положительная, «пуговка» - отрицательная)

• обнаружение вирусных включений

• цветная проба

• метод бляшек во флаконе

21. Методы определения родовой и видовой идентификации прокариот. Диагностическое значение экзоферментов прокариот. Диагностическое значение бактериофагов.

Индентификация рода – окраска по Граму

Идентификация вида:

- биохимическая активность (опред. набор пищеварительных ферментов)

- факторы патогенности (токсины и ферменты агрессии)

- восприимчивость к видовому бактериофагу

- антигенная структура

- биологическая картина у животных

21. Действие физических факторов на микробов. Температурные критерии жизнедеятельности микробов. Механизмы устойчивости микробов к высушиванию, излучениям.

Из физических факторов наибольшее практическое значение имеют температура, высушивание, излучения. В зависимости от температурного режима жизнедеятельности микроорганизмы делятся на три группы:

• психрофилы (оптимум 6 – 20˚С)

• мезофилы (34 – 37˚С)

• термофилы (выше 37˚С, у некоторых – до 80˚С)

Низкие температуры большинство микроорганизмов, в том числе и вирусы, переносит хорошо. Вегетативные клетки бактерий находятся при этом в анабиотическом состоянии. Также хорошо сохраняются культуры микробов и различного рода биологически активные препараты (например, вакцины). Некоторые бактерии остаются жизнеспособными при –190˚C,а бактериальные споры при –250˚C. Высокая температура, как правило, губительно действует на вегетативные формы бактерий и вирусы в результате денатурации белков. В естественных условиях высушивание оказывает губительное действие на вегетативные клетки многих бактерий, что связано с обезвоживанием их цитоплазмы и повреждением ЦПМ и рибосом. Высушенные споры бактерий сохраняют способность к прорастанию в течение 10 лет, а споры плесневых грибов – до 20 лет. Лиофильная сушка (высушивание в условиях вакуума из замороженного состояния) применяется для хранения микробных культур и биологических препаратов в течение длительного срока без потери их биологических свойств. Прямые солнечные лучи обладают бактерицидным свойством, которое обусловлено активностью их коротковолновой части – УФ-лучей с длиной волны 254 – 300 нм. Механизм их действия связан с образованием тиминовых димеров в ДНК бактериальной клетки. Бактерии и вирусы также чувствительны к проникающей радиации. Однако они погибают только при облучении сравнительно большими дозами, порядка 44000 – 280000 Р. Эти свойства применяются для стерилизации.