81. Реакция нейтрализации токсинов и вирусов: сущность, способы постановки и учета, диагностическое значение.

Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие мик­робов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микро­бных антигенов антителами, т. е. их нейтрали­зацией. Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело жи­вотным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем дейс­твии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.

82. Иммунолюминесцентный метод: сущность, направления, способы постановки и учета, диагностическое значение.

Иммунофлюоресцентный анализ. Один из наиболее чувст­вительных методов выявления связывания антител с антигена­ми в клетках и тканях — иммунофлюоресцентный анализ. Спе­циальный флюоресцентный краситель (флюорохром) прикреп­ляется химической связью к молекуле специфического анти­тела, не нарушая его специфичности. Часто используют кра­ситель изотиоцианат флюоресцеина, обладающий желто-зеле­ной флюоресценцией. Красители, выбранные для иммунофлю- оресцентного метода, активируются светом одной длины вол­ны (чаще — ультрафиолетовой части спектра), а сами испуска­ют лучи другой длины волны (видимого спектра). В люмине­сцентном микроскопе используется в качестве источника све­та, возбуждающего люминесценцию, ртутная лампа с системой селективных фильтров, пропускающих в окуляр только свет флюоресцирующего красителя. Прикрепляя разные красители к разным антителам, можно одновременно выявлять несколько антигенов в одной клетке.

Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного мик­роорганизма в исследуемом материале, в связи с чем его на­зывают методом экспресс-диагностики.

Недостатком прямого иммунофлюоресцентного метода яв­ляется необходимость приготовления широкого набора флюо­ресцирующих специфических антител против каждого из изу­чаемых антигенов. Поэтому чаще используют непрямой имму­нофлюоресцентный метод, при котором связанные с антиге­ном специфические антитела (немеченые) выявляются с помо­щью флюоресцирующих антииммуноглобулиновых антител против иммуноглобулинов того вида, которому принадлежат антиген-специфические антитела.

Применяют и иммуногистохимический метод, при котором к специфическим антителам прикрепляется фермент (напри­мер, пероксидаза хрена), способный превратить бесцветный субстрат в окрашенные продукты его ферментативного разло­жения, видимые в обычный световой микроскоп.

Для использования при электронной микроскопии антиген- специфические антитела можно метить частицами золота, ло­кализация которых укажет на расположение соответствующего антигена.

При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса спе­цифические флюоресцирующие антитела образуют комплексы с микробными антигенами, которые светятся при люмине­сцентной микроскопии препаратов (рис. 10.1.2).

Непрямой метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки — антиглобулиновой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов, поскольку диагностические антисыворотки получают путем иммунизации кроликов. При этом на образующемся комплексе (специфические антитела + исследуемый антиген) фиксируют­ся флюоресцирующие антиглобулиновые антитела, обеспечи­вая его свечение при люминесцентной микроскопии.

На предметном стекле готовят мазок из исследуемого мате­риала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кро­личьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген—антитело

препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связывающихся с антигеном антител. Затем на препарат нано­сят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против иммуноглобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоничес­ким раствором хлорида натрия. В результате связывания флю­оресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированны­ми на антигене специфическими антителами образуются све­тящиеся комплексы антиген—антитело, которые обнаружива­ются при люминесцентной микроскопии.