76. Реакция преципитации: сущность, условия и способы постановки и учета, диагностическое значение. Использование при определении уровня иммуноглобулинов в крови.

Реакция преципитации и ее варианты. Реакция преципи­тации характеризуется осаждением специфических мелкодис­персных антигенов эквивалентным количеством антител в при­сутствии электролита. Выпадение нерастворимого комплекса антиген—антитело в виде осадка наблюдается лишь при экви­валентных соотношениях ингредиентов, поскольку образовав­шийся комплекс может раствориться в избытке антигена или антител. Антиген должен иметь характер прозрачного колло­идного раствора.

В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний реакция преципитации служит главным образом для выявле­ния или идентификации антигена (преципитиногена) по из­вестной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела (преципитины). Для приготовления коллоидных растворов антигенов, участвующих в реакции преципитации, используют различные методы их экстракции из исследуемого материала (шкуры, шерсть, мясо животных).

Реакция преципитации проводится с прозрачными колло­идными растворимыми антигенами, экстрагированными из па­тологического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагнос­тические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого пре­ципитата—помутнение.

Реакция колыдепреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2—0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1—0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторож­но переводят в вертикальное положение. Учет реакции произ­водят через 1—2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появля­ется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробир­ках преципитат не образуется .

Реакция преципитации в геле. Чашки заливают ага­ром, в котором вырезают несколько лунок на равном рассто­янии друг от друга. В центральную лунку вносят сыворотку, содержащую антитела, в остальные — различные испытуемые антигены или один и тот же антиген в различных разведениях. При диффузии реагентов в агаровом геле в зонах оптимальных соотношений на месте встречи антигена и антител образуются мутные полосы — дуги преципитации.

В случае постановки реакции преципитации с различными разведениями антигена можно установить титр преципитирующей сыворотки — максимальное разведение антигена, которое дает преципитацию с данной сывороткой. Одна из разновид­ностей реакции преципитации в геле позволяет определить токсигенность исследуемых бактерий, например бактерий диф­терии. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются ли­нии преципитации в виде дуг.

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ). Иммуноэлектрофоретический анализ представляет собой сочетание электрофореза в ага­ровом геле с иммунодиффузией. Вначале проводят электрофоретическое разделение белков в агаровом геле. После разделе­ния в канавку, которая идет параллельно линии миграции белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Ан­тигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число, положение и форма которых дают пред­ставление о составе исходной смеси антигенов. ИЭФ — один из широко распространенных методов качественного анализа антигенов. Располагая соответствующими преципитирующими антисыворотками, с его помощью можно исследовать любую антигенную смесь. В частности, успешно анализируются белки сыворотки крови, спинномозговой жидкости, мочи, молока, экстрактов из органов, а также белки растительного и бакте­риального происхождения.

Реакции преципитации (РП) [от лат. praecipito, осаждать] предложены Краусом (1897) и основаны на феномене образования видимого осадка (преципитата) или общего помутнения среды после взаимодействия растворимых либо находящихся в коллоидном дисперсном состоя­нии Аг с AT. РП ставят в специальных узких пробирках. В качестве реагентов используют гипериммунные преципитирующие сыворотки с высокими титрами AT к гомологичным Аг. При постановке РП разводят не сыворотку, а Аг. Реакционная среда должна содержать электро­литы (физиологический раствор) и иметь нейтральный рН. РП позволяет быстро (в течение нескольких секунд) выявлять незначительные количества Аг. Они очень чувствительны, и их применяют для тонкого иммунохимического анализа, выявляющего отдельные компоненты в смеси Аг. Метод имеет несколько разновидностей.

Реакция кольцепреципитации. На слой антисыворотки наслаивают жидкость, содержа­щую растворимый Аг, и через несколько секунд наблюдают образование кольца преципитата. Широкое распространение получила реакция термопреципитации Асколи на Аг возбудителя сибирской язвы, использующая Аг, экстрагированные кипячением из различного сельскохозяйственного сырья. Реакцией кольцепреципитации также выявляют AT к бруцеллам в молоке (кольцевая проба Банга).

Реакция микропреципитации. Для выявления низких титров AT (например, при сенси­билизации к JIC) применяют нефелометрическую реакцию микропреципитации (или реакция помутнения), предложенная Уаньё (1955). При её постановке в исследуемую сыворотку крови вносят Аг в убывающей концентрации; при отсутствии AT разведение сыворотки крови Аг уменьшает её оптическую плотность. Однако в присутствии минимальных количеств AT образу­ются микропреципитаты, повышающие оптическую плотность среды.

Реакция флоккуляции (от лат. хлопья шерсти) — РП в системах токсин-антитоксин и анатоксин-антитоксин, проявляющиеся появлением хлопьевидного осадка или опалесценции при избытке Аг. Реакции возможны только с лошадиными (но не с кроличьими) антитоксическими сыворотками или антитиреоглобулиновыми человеческими антисыворотка­ми. Механизм реакции обусловлен растворимостью и авидностью AT. Реакцию обычно приме­няют для определения активности антитоксинов.

РП в геле. Широкое распространение получили модификация РП — РП в геле; методически они отличаются от РП тем, что преципитирующая сыворотка уплотняется добавлением геля (агар, агароза, карбоксиметилцеллюлоза и др.). Известны простая одномер­ная иммунодиффузия (по Удену), двойная (встречная) одномерная иммунодиффузия, радиаль­ная иммунодиффузия (по Манчйни) и двойная (встречная) радиальная иммунодиффузия (по Оухтерлони). Методы простой диффузии основаны на способности Аг, внесённого в лунки, диффундировать в гель. При постановке реакций двойной диффузии AT и Аг вносят в отдельные лунки. Обычно методы используют для выявления белковых Аг в различных жидкостях и ткане­ их экстрактах. Вариантом простой одномерной иммунодиффузии является тест Илека для иявления токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Иммуноэлектрофорез. Метод объединяет РП в геле с электрофорезом. Для этого слой агapa наносят на предметное стекло; на его разных краях вырезают две лунки, а в центре — азделяющую их канавку. В лунки вносят смесь Аг и проводят электрофорез в течение 1-2 ч. азличные Аг с разной скоростью перемещаются между катодом («старт») и анодом («финиш»), атем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через 5-7 сут в геле образуются зоны реципитации. Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями (например, амидо чёр­ным). Более информативный и быстрый — метод встречного иммуноэлектрофореза (элект- росинерез). Его принцип основан на контакте Аг и AT, обусловленном не их свободной диффузией, а эффектом постоянного электрического поля, усиливающего способность к взаимодей­ствию низкореактогенных Аг и AT. Основное условие для применения метода — наличие злектрофоретической подвижности Аг, отличной от таковой у AT. Основные достоинства метода - высокая чувствительность, в 10 раз превышающая чувствительность метода двойной иммунодиффузии; возможность идентификации Аг, не выявляемых методом диффузии, и скорость — результаты можно учитывать через 1-3 ч.