1. Коньюгация у бактерий, механизм, использование.

Конъюгация – процесс генетического обмена, сопровождающийся переносом генетической информации от клетки донора к клетке-реципиенту, который осуществляется при непосредственном контакте клеток между собой.

Открыта Дж. Ледербергом и Э. Татумом в 1946 г. в экспериментах с полиауксотрофными штаммами бактерий E. coli.Они пытались доказать существование генетической рекомбинации у бактерий E. coli. Два ауксотрофных мутантных штамма E. coli генотипы: штамм А – met– bio– thr+ leu+ thi+, штамм В – met+ bio+ thr– leu– thi– . Культуры смешивали и инкубировали при оптимальных условиях в течение промежутка времени. Центрифугировали и высевали на агаризованную минимальную глюкозо-солевую среду. После инкубир 37.С на этой среде сформировались колонии met+ bio+ thr+ leu+ thi+.

Выяснилось, что происхождение таких рекомбинантов нельзя объяснить трансформацией, так как

для их появления необходим непосредственный контакт между бактериями штаммов А и В.

В 1949 г. Б. Дэвис получил дополнительные данные, эксперимент в U-образной пробирке.

Позднее У. Хейс показал, что существуют бактерии мужского (доноры) и женского (реципиенты) типа и вклад их в конъюгацию не равнозначен. Перенос генетического материала происходит в одном направлении – от донора к реципиенту и процесс рекомбинации протекает в клетках штамма-реципиента.

У. Хейс ввел понятие о наличии в донорных клетках F-фактора (fertility – плодовитость) и обозначил доноры F+-клетками, а реципиенты – F–-клетками. Механизм передачи хромосомных генов при конъюгации был объяснен Ф. Жакобом и Е. Вольманом в середине 1950-х годов. Этому способствовало:

• выделение донорных штаммов, которые с высокой частотой передавали хромосомные гены в реципиентные клетки. В результате рекомбинации генов донорной хромосомы с хромосомой реципиента образовывались рекомбинанты по разным признакам. Такие донорные штаммы получили название Hfr соответственно первым буквам от английского high frequency of recombination;

• разработка в лаборатории А. Львова метода скрещивания с прерыванием конъюгации, суть которого заключается в том, что если в процессе скрещивания производить механическое встряхивание,

то формирующиеся конъюгационные пары разрушаются и перенос генов

прерывается.

Вывод, что перенос генетического материала от Hfr-донора в реципиентные F–-клетки происходит ориентированно, т. е. в том же порядке, в каком гены расположены на хромосоме. Точка, с которой начинается передача хромосомы, называется точкой начала переноса или ориджин (обозначается «оri» или «о»). В настоящее время образование Hfr-штаммов объясняют моделью, предложенной А. Кемпбеллом: F-фактор, имеющий, как и хромосома, кольцевую структуру, в своем составе несет нуклеотидные последовательности, гомологичные последовательностям бактериальной хромосомы. Ими являются IS2-, IS3-элементы и транспозон Tn1000. В F-факторе присутствуют два IS3-элемента – один IS2-элемент и один транспозон Tn1000, а в хромосоме бактерий E. coli имеются шесть или более копий IS2-элемента, до пяти копий IS3-элемента и несколько копий Tn1000, которые могут локализоваться в различных ее участках. За счет IS-элементов, транспозонов F-фактора и хромосомы происходит гомологичная рекомбинация с последующей интеграцией F-фактора в хромосому.

Таким образом, можно считать, что в зависимости от состояния F-фактора различают два типа донорных клеток: • F+-доноры, у которых F-фактор находится в автономном от хромосомы состоянии. При скрещивании F+-доноров с F–-реципиентами передается, как правило, только F-фактор;

• доноры Hfr-типа, у которых F-фактор интегрирован в хромосому. При скрещивании Hfr-доноров с F–-реципиентами передаются хромосомные гены с образованием рекомбинантов:

Интеграция F-фактора в бактериальную хромосому обратима. F-фактор может исключаться из хромосомы, и в этом случае клетка Hfr становится F+-клеткой. Процесс вырезания, или эксцизии, F-фактора происходит примерно с такой же частотой, что и интеграция. Однако в редких случаях может происходить неправильная эксцизия F-фактора из бактериальной хромосомы, что свя-зано с незаконной или запрещенной рекомбинацией, возникающей между негомологичными генетическими участками полового фактора и хромосомы. В результате такого процесса незаконной рекомбинации в состав полового фактора включается фрагмент бактериальной хромосомы.

F-факторы, содержащие фрагменты хромосомной ДНК, получили название F’-факторов, а штаммы содержащие такие F’-факторы – F’-донорами или донорами промежуточного типа.

В соответствии с величиной фрагмента хромосомы, интегрированного в состав F’-фактора, различают малые и большие F’-факторы. Малые F’-факторы несут в своем составе один ген, большие – до половины бактериальной хромосомы.

F’-факторы, как и обычные F-факторы, с высокой эффективностью

передаются при конъюгации F–-клеткам.Такой тип передачи генов получил название сексдукции или F-дукции, что схематично можно изобразить следующим

образом: F’lac+*F-lac-=lac-/ F’lac+

В результате скрещивания такого типа реципиентная клетка приобретает способность к сбраживанию лактозы и несет аллель как lac+ (находится в составе F’-фактора), так и аллель lac– (в хромосоме). Клетки, в которых определенные нуклеотидные последовательности представлены в двойном наборе – в составе хромосомы и в F’-факторе, называются гетерогенотами. У них обнаружена повышенная способность к образованию Hfr-клеток. При этом интеграция F’-фактора осуществляется в области хромосомы, гомологичной фрагменту, включенному в состав F’-фактора. В противоположность этому, F-фактор F+-клетки не имеет предпочтительного места соединения с хромосомой.

На первых этапах после смешивания донорных и реципиентных клеток в результате случайных контактов формируются конъюгационные пары. Контакты клеток беспорядочны. Однако установлено, что скорость конъюгации в определенных пределах пропорциональна концентрации бактерий.Обычно донорных примерно в 10 раз меньше, чем реципиентных бактерий.

С помощью электронного микроскопа показано, что между клетками в таких парах образуется конъюгационный мостик. Половые пили обеспечивают взаимное узнавание при контакте донорных и реципиентных клеток. Они прикрепляются к специфическим рецепторам, находящимся на поверхности реципиентных клеток. Благодаря способности половых пилей сокращаться, клетки донора и реципиента вступают в контакт «клеточная стенка к клеточной стенке», а затем между клетками возникает более сложное образование – конъюгационный мостик, по которому ДНК переходит из клетки-донора в клетку реципиента.

Во время конъюгации в донорных клетках осуществляется репликация ДНК по типу «катящегося кольца» или «разматывающегося рулона». Для этого фермент эндонуклеаза в точке начала передачи F-фактора разрезает одну из нитей ДНК с образованием 5.- и 3.-ОН-концов. На 3.-ОН- конце с помощью ДНК-полимеразы III происходит наращивание нуклеотидов, комплементарных нуклеотидам неповрежденной нити ДНК. Второй конец (5.-конец) разрезанной нити начинает отходить в виде «хвоста» и переходит по конъюгационному мостику в реципиентную клетку, где служит матрицей для синтеза второй нити. После репликации в реципиентной клетке двухцепочечная ДНК вступает в гомологичную рекомбинацию с ДНК реципиентной клетки. Образуются рекомбинанты, которые при данном способе обмена генетической информацией называются трансконъюгантами.

Таким образом, в процессе конъюгации можно различить следующие стадии:

образование неэффективных пар/эффективных конъюгационных пар/перенос генетического материала/постконъюгационный синтез донорной ДНК в реципиентной клетке/гомологичная рекомбинация перенесенного фрагмента донорной ДНК с ДНК реципиентной клетки.

Как способ генетического обмена конъюгация используется в следующих направлениях.

1. Передача многих генетических маркеров из одних клеток в другие.

2. Метод конъюгационного скрещивания удобен для картирования хромосомы. Карта хромосомы у бактерий строится в минутах. У бактерий E. coli началом карты (0 мин) являются точки треон и лейц.

3. Изучение генетического аппарата у бактерий. 4. Изменчивости бактерий.

2. Свободноживущие азотфиксирующие бактерии

Клубеньковые бактерии – это грамотрицательные подвижные палочки. Они относятся к микроаэрофильным микроорганизмам, способным развиваться при низком парциальном давлении кислорода в среде. Оптимальная для роста клубеньковых бактерий температура 24–26С. Клубеньковые бактерии хемогетеротрофы, т. е. в качестве источника углерода и энергии используют органические вещества, часто нуждаются в некоторых витаминах – тиамине, пантотеновой кислоте, биотине. Они

обычно существуют свободно в почве, их количество зависит от характера почвы и ее предшествующей сельскохозяйственной обработки. При свободном существовании в почве используют связанный азот, т. е. утрачивают способность фиксировать азот атмосферы.

Клубеньки с леггемоглобином имеют розовый цвет и способны фиксировать молекулярный азот. При разрушении леггемоглобина образуются зелен. пигм. биливердины молекулярный азот не фиксируют.

К симбиотическим азотфиксаторам относятся также актиномицеты, принадлежащие к роду Frankia (способны к азотфиксации и в свободноживущем состоянии).

Цианобактерии – многоклеточные организмы, отдельные их клетки при отсутствии связанного азота превращаются в специализированные формы, получившие название гетероцисты, в которых и происходит фикация атмосферного азота. В гетероцистах нитрогеназа защищена от ингибирующего действия молекулярного кислорода за счет образования дополнительных поверхностных оболочек.

Среди них выделяют как свободноживущие (бактерии родов Azotobacter, Azomonas, Beijerinсkia, Derxia, Azospirillum, некоторые виды родов Clostridium, Klebsiella, Pseudomonas, некоторые цианобактерии, пурпурные бактерии и зеленые серные бактерии и др.), так и симбиотические (бактерии родов Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Frankia, некоторые виды родов Chromatium, Klebsiella, некоторые цианобактерии и др.). В процессе биологической фиксации молекулярный азот восстанавливается до аммиака.