2. Нуклеоид. Репликация днк.

Генетический материал прокариот представлен молекулой (молекулами) ДНК, уложенной в компактную структуру и локализованной в ограниченных участках цитоплазмы, не имеющей, в отличие от эукариот, собственной ядерной мембраны. Учитывая эти особенности, генетический аппарат прокариот принято называть нуклеоидом.

Тот факт, что в состав нуклеоида входит ДНК, впервые удалось показать Ж. Кейрнсу с помощью метода радиоавтографии.

Стабилизирующую роль в такой организации играют специфические белки. У бактерий кишечной группы известно по меньшей мере пять белков – HU, INF, H1, HLP1 и H, которые способствуют «упаковке» ДНК. Они сходны по аминокислотному составу и другим свойствам с гистонами эукариот, имеют сравнительно небольшие размеры (9–28 кД) и в большинстве своем относятся к основным. Наибольшее значение в играет белок HU. Связываясь с ДНК, он меняет конформацию ее витков.

Важную роль играет прикрепление нуклеоида к цитоплазматической мембране. Имеются фиксированные точки прикрепления нуклеоида к мембране: точка начала репликации и точка завер-

шения репликации. Кроме того, нуклеоид имеет «скользящие участки» прикрепления к мембране,тот участок, в котором в данный момент идет репликация, и большое кол-во «неспецифических» точек.

В зависимости от условий нуклеоид бактериальной клетки может состоять из одной или нескольких копий одной и той же хромосомы. Так, у Azotobacter chroococcum в экспоненциальной фазе роста

на одну клетку приходится 20–25 копий хромосомы, у Desulfovibrio gigas – 9–17 копий хромосомы.

У одной из наименьших по размеру бактерий Mycoplasma genitalium, вызывающей у людей уретриты, хромосомная ДНК равна 580.070 п. н.; у бактерий E. coli – 4.653.831 п. н. Нить хромосомной ДНК у бактерий E. coli имеет линейный размер в 1,6 мм, а длина упакованного нуклеоида – 1 мкм, что короче хромосомы в 1600 раз.

Уже отмечалось, что большинство бактерий – гаплоидные организмы. Однако у различных видов бруцелл, Rhodobacter sphaeroides, Agrobacterium tumefaciens, Leptospira interrogans клетки имеют по две хромосомы, различающиеся между собой по величине. У Burkholderia cepacia имеются даже три.

Актиномицеты –ложное кольцо. Линейная хромосома была обнаружена и у Rhodococcus fascians. Считается, что теоретически возможны три механизма репликации ДНК:

1. Консервативный, при котором сохраняется целостность всей родительской двойной спирали (не происходит раскручивания спирали), и она является матрицей для синтеза себе подобной.

2. Дисперсивный, в соответствии с которым родительская молекула ДНК распадается на фрагменты, а синтез новых цепей происходит на фрагментах, которые затем крест-накрест объединяются с отрезками нового материала.

3. Полуконсервативный предполагает, что родительская двойная спираль раскручивается, и каждая полинуклеотидная цепь служит матрицей для синтеза новой комплементарной цепи.

В 1957 г. М. Меселсон и Ф. Сталь экспериментально доказали, что репликация хромосомной ДНК у бактерий происходит по полуконсервативному механизму.

В этом процессе участвует несколько ферментов, основными из них являются:

1) ДНК-геликазы, перемещающиеся по цепи ДНК в направлении 5*>3* и перемещающиеся в направлении 3*>5*;

2) SSB-белки (single strand binding – связывающиеся с однонитевой ДНК), которые связываются с однонитевой ДНК и препятствуют ее ренатурации;

3) ДНК-гиразы, или топоизомеразы, белки, которые снимают напряжение при раскручивании кольцевых молекул ДНК и способствуют ее расплетанию.

На образовавшихся однонитевых участках ДНК идет синтез комплементарных цепей. У бактерий E. coli синтезируются три типа ДНК-полимераз (I, II и III). Главную роль играет ДНК-полимераза III.

Доказано, что синтез ДНК протекает только в направлении от 5* к 3*-ОН концу. Синтез одной из дочерних цепей осуществляется непрерывно с помощью ДНК-полимеразы III в направлении 5*> 3*.

Эта цепь называется ведущей, или лидирующей.

Копия второй цепи называется запаздывающей и она синтезируется из фрагментов ДНК размером 1000–2000 нуклеотидов, которые называются фрагментами Оказаки. Для синтеза фрагментов Оказаки

необходима «затравка», или праймер. К этой затравке ДНК-по-лимераза III присоединяет дезоксирибонуклеотиды, в результате образуются фрагменты Оказаки. РНК-праймеры удаляются за счет активности ДНК-полимеразы I, после чего лигаза сшивает отдельные фрагменты Оказаки друг с другом и целостность новой цепи восстанавливается.

Репликация всего кольца ДНК может происходить как в одном, так и в двух противоположных направлениях двойной спирали, что соответственно предполагает наличие одной или двух репликативных вилок на одной молекуле ДНК.

Обычно деление бактериальной клетки по времени осуществляется после завершения цикла репликации молекулы ДНК.

Бактериальную ДНК можно обнаружить в мембранных фракциях после центрифугирования клеточных лизатов, а также с помощью электронной микроскопии удалось визуализировать места прикрепления хромосомы к впячиваниям мембраны (мезосомам).

Существуют две модели, объясняющие регуляцию репликации бактериальной ДНК. Согласно модели, предложенной Ф. Жакобом, С. Бреннером и Ф. Кьюзеном (1963), структура, способная самостоятельно реплицироваться, называется репликоном: это относится к хромосомам и плазмидам бактерий. Репликон должен иметь кольцевую форму и реплицироваться не по частям, а как единое целое. Согласно этой модели, репликон должен быть прикреплен к цитоплазматической мембране и обяза-

тельно обладать двумя специфическими детерминантами или генами – структурным геном и геном-репликатором (или оператором репликации). При росте клетки от мембраны поступает сигнал на структурный ген и активирует его. Происходит синтез специфического белка-инициатора, который действует на ген-репликатор, что приводит к началу процесса репликации, который продолжается вдоль всего репликона и заканчивается копированием всей его структуры. После репликации ДНК поступает обратный сигнал на мембрану, инициируя деление клетки. Данная модель получила название модели позитивной регуляции репликации.

Кроме того, существует модель негативной регуляции репликации (Р. Притчард, П. Барт, Дж. Коллинз, 1969). В соответствии с этой моделью в составе репликона есть ген, отвечающий за синтез белка-репрессора, который при высокой концентрации негативно действует на инициацию репликации, а в малой концентрации не влияет на этот процесс. По мере роста клетки концентрация репрессора снижается и создается возможность репликации хромосомы или плазмиды.

3. Микробный антогонизм

один вид микроорганизмов полностью или частично подавляет рост и развитие других видов.

1. Антагонизм, складывающийся при совместном развитии разных видов, нуждающихся в одних и тех же питательных веществах. В этом случае преимущества будут у того микроорганизма, скорость роста

которого выше скорости роста других. Так, при совместном высеве на питательный субстрат, необходимый одновременно для роста и эубактерий и актиномицетов, эубактерии будут развиваться быстрее.

2. Антагонизм, связанный с образованием микроорганизмами органических кислот, спиртов, сидерофоров или других продуктов обмена, которые изменяют условия среды, делая ее непригодной для развития других микроорганизмов. В процессе смены микрофлоры свежего молока в нем содержатся как молочнокислые, так и гнилостные бактерии. Вначале они развиваются одинаково, но в результате размножения молочнокислых бактерий накапливается молочная кислота и молоко значительно подкисляется. В этих условиях наблюдается подавление роста, а затем и полная гибель гнилостных бактерий. При развитии уробактерий на среде, содержащей мочевину, происходит ее дезаминирование. Выделение аммиака происходит в таком количестве, которого достаточно для подщелачивания среды до рН 9,0.

3. Антагонизм, связанный с образованием и выделением в окружающую среду антибиотических веществ (антибиотиков, бактериоцинов и др.)

Билет 28

1. Цитоплазма. Производные цитоплазмы.

это содержимое клетки, окруженное цитоплазматической мембраной. Фракция цитоплазмы, имеющая гомогенную консистенцию и содержащая набор растворимых РНК, ферментных белков, продуктов и субстратов метаболических реакций, получила название цитозоля.

Рибосомы прокариот имеют константу седиментации 70S. Они образованы двумя субъединицами – 30S и 50S. Меньшая субъединица 30S сод. 16S-рРНК и в большинстве случаев по одной молекуле белков 21 вида. Субъединица 50S состоит из двух типов молекул рРНК (23S и 5S) и около 35 молекул белков.

Рибосомы служат местом синтеза белка. Синтез белка осуществляется агрегатами, состоящими из рибосом, РНК – иРНК и тРНК. Такие агрегаты наз-ся полисомами. Включения подразделяются на активно функционирующие структуры и продукты клеточного метаболизма откладывающиеся внутри

1. Аэросомы снижают удельную массу бактериальной клетки и благодаря этому поддерживают ее во взвешенном состоянии в водоеме. Аэросома представляет собой скопление газовых пузырьков (везикул), которые имеют веретенообразную форму. Их оболочка состоит только из белка, т. е. устроена не так, как обычная мембрана. Белковые молекулы ориентированы таким образом, что внутренняя сторона оказывается гидрофобной, а наружная – гидрофильной.

Хлоросомы зеленых бактерий и фикобилисомы цианобактерий. Пигменты, поглощающие кванты света и передающие энергию возбуждения на фотореакционные центры. Это эллипсовидные образования, окруженные тонкой белковой оболочкойиз отдельных глобул.

Карбоксисомы, или полиэдрические тела, содержатся в клетках некоторых автотрофных бактерий. Они имеют форму многогранника диаметром 90–100 нм, окруженного однослойной белковой оболочкой. В

карбоксисомах содержится рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилаза – ключевой фермент, катализирующий фиксацию СО2 в цикле Кальвина в процессе фото- и хемосинтеза.

Магнитосомы содержатся в водных бактериях, способных ориентироваться в магнитном поле и перемещаться в направлении линий магнитного поля. В их состав входит 0,4 % железа (по сухому веществу). Магнитосомы располагаются в клетках вблизи мест прикрепления жгутиков.