2,Транспорт веществ через биомембрану.

Мембрана клетки представляет собой барьер для ионов: перемещение ионов из воды в центр мембраны энергетически невыгодно, поскольку сопряжено с затратами энергии на освобождение иона от гидратной оболочки. Наиболее адекватной количественной моделью такого перехода является модель Борна. Работа, необходимая для переноса иона с зарядом q и радиусом r из среды с диэлектрической проницаемостью в среду с диэлектрической проницаемостью , определяется по формуле:

(XI.1)

Диэлектрическая проницаемость воды равна примерно 80; для внутренней части мембраны обычно используют характерную для углеводородов величину . Тогда работа, совершаемая при переносе иона с валентностью Z, составит ккал/моль; для перемещения внутрь мембраны одновалентного иона радиусом 0,2 нм нужно затратить энергию около 40 ккал/моль. Ясно, что такое перемещение энергетически весьма невыгодно, иными словами, бислой является труднопреодолимым барьером для ионов.

Тем не менее транспортные процессы являются основой для понимания механизма формирования потенциала покоя между поверхностями мембраны и потенциала действия, поэтому им необходимо уделить особое внимание. Важную роль в описании транспортных процессов играет понятие свободной энергии Гиббса. Дело в том, что тепловая энергия при постоянной температуре не может быть использована для совершения работы. Протекание химических реакций в жидкой фазе не изменяет давление, но может изменить объем. Для таких систем вместо изменения внутренней энергии системы используется изменение ее энтальпии ( ), которое равно , где Р- давление, -изменение объема, - изменение внутренней энергии. Между изменением свободной энергии и изменением энтальпии при постоянном давлении и температуре существует соотношение, вытекающее из первого и второго законов термодинамики:

(XI.2)

Энергия Гиббса, приходящаяся на 1 моль вещества, называется электрохимическим потенциалом , т.е. при этом изменение энергии Гиббса будет вычисляться по формуле , где m - число молей вещества.

В дальнейшем мы будем различать пассивный и активный транспорт; под термином «пассивный транспорт» будем понимать движение частиц из области с большим значением электрохимического потенциала в область с его меньшим значением (при котором энергия Гиббса понижается и <0), а под термином « активный транспорт» - обратное движение из мест с меньшим в места с большим значением электрохимического потенциала, сопровождающееся повышением энергии Гиббса >0) и предполагающее необходимость затраты внешней энергии.

3. Оптическая микроскопия.

Наблюдать структуру мембраны в обычный оптический микроскоп нельзя. Чтобы это понять, вспомним, что такое предел разрешения прибора Z. Это минимальное расстояние между двумя точками, изображения которых еще можно увидеть раздельными. Естественно, что чем меньше Z, тем качественнее прибор, так как позволяет видеть более мелкие структуры. Для грубой оценки разрешения оптического микроскопа используем соотношение: .

В качестве для оценки подставим в формулу минимальное значение длины волны видимого света ( ) и получим для предела разрешения Z=200 нм.

Эта величина примерно в 20 раз больше толщины мембраны, поэтому о наблюдении мембраны в оптический микроскоп не может быть и речи. Но возможно использование микропроекции и микрофотографии.

Формирование микроскопического изображения происходит с участием человека и завершается образованием действительного изображения в глазу. Обычный микроскоп сам по себе не создает действительное изображение. Однако для фотографирования (микрофотография) или проекции микроскопического изображения на экран (микропроекция) должно быть получено действительное изображение. Для этого изображении, даваемое объектовомОб, надо расположить дальше фокусного расстояния окуляра

Электронная микроскопия.

Для исследования структуры мембран используется электронный микроскоп, предел разрешения которого определяется длиной волны де Бройля для движущегося с высокой скоростью электрона: ,

где h – постоянная Планка; m - масса электрона; - скорость электрона. Предел разрешения электронного микроскопа может достигать . Для получения четкой электронограммы клетки ее мембраны контрастируют, осаждая на них вольфрам, осмий и другие химические элементы, которые хорошо поглощают и рассеивают электроны.

Для исследования мембран используются методы замораживания-скалывания и замораживания-травления. Препараты быстро замораживают, не подвергая их каким-либо повреждающим воздействиям, как при получении тонких срезов. Подготовка препарата включает ряд операций.

После замораживания образец, представляющий собой суспензию клеток, скалывают с помощью ножа при низкой температуре (-100 ⁰С) в глубоком вакууме. При скалывании образуется срез, проходящий через образец. Оказалось, что если плоскость среза проходит через мембрану, она раскалывается преимущественно по срединной области и расщепляется на две половины. На образовавшихся плоскостях скола обнажается внутренняя область мембраны.

При необходимости образец подвергают травлению и проводят обычную возгонку льда в вакууме. Это позволяет лучше визуализировать поверхностные структуры клеточных мембран. После этого получают так называемую реплику с обнаженной поверхности. Эту реплику и изучают методом электронной микроскопии. Для получения реплики сначала напыляют на образец платину под углом около 45⁰, чтобы выявить топологические характеристики препарата. Затем платиновой реплике придают механическую прочность, нанося на нее слой углерода. После этого препарат оттаивают, реплика всплывает, и ее вылавливают с помощью специальной сеточки.

4. МЕТОД ДИФРАКЦИИ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ.

Использование рентгеновского излучения для анализа мембранных структур обусловлено тем обстоятельством, что одним из главных условий проявления дифракции является сопоставимость размеров объекта, на который направляется излучение, и длины волны этого излучения. Для анализа объектов нанометрового диапазона необходимо рентгеновское излучение (диапазон длин его волн от 10^-5 до 80 нм).

Чтобы понять принцип использования рентгеновского излучения для анализа структуры вещества, рассмотрим кристаллическую структуру, на два соседних атома которой падают параллельные лучи (рис.5), которые отражаются от соседних атомов кристаллической решетки, а затем интерферируют, собираясь в одну точку на некотором экране. Вводя значение межатомного расстояния d , угла скольжения , получим, что разность хода лучей .

_{Условием того, что в некоторой точке экрана две волны будут усиливать друг друга, является равенство этой разности хода целому числу длин волн:}

ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕМБРАН.

Эти методы связаны с использованием флуоресцентных меток флюоресцирующих молекулярных групп, тем или иным способом связываемых с исследуемыми молекулами и позволяющих визуализировать многие процессы.

Флуоресцентный анализ дает возможность исследовать подвижность фосфолипидных молекул в мембране, оценить вязкость липидной фазы мембраны (так называемую микровязкость мембран). Микровязкость мембраны можно оценить по изменениям спектров флюоресценции, а также по степени поляризации флюоресцентного излучения при освещении мембраны поляризованным светом. Связь степени поляризации и микровязкости мембраны выражается формулой Перрена и Яблонского, из которой следует, что чем менее поляризовано люминесцентное излучение (возникшее в ответ на внешнее облучение мембраны), тем более подвижны молекулы в исследуемом участке и тем меньше там микровязкость. Наоборот, чем выше степень поляризации люминесцентного света, тем меньше подвижность и больше микровязкость.

Метод ультрахимии.

Этот метод применяется при исследовании химического состава клеток. Он основан на получении вещества из клетки, отдельных ее частей и органоидов в очень небольших количествах. В последующем проводится качественный и количественный анализ полученных веществ специальными химическими методами.

ЯМР и ЭПР исследования.

Наиболее полные сведения об агрегатном состоянии липидных бислоев дают методы радиоспектроскопии ЭПР и ЯМР.

Электронный парамагнитный резонанс – это явление резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волны системой парамагнитных частиц (электронов с некомпенсированными спинами), помещенных во внешнее магнитное поле при резонансной частоте волны. Использование ЭПР заключается в исследовании спектров ЭПР. Спектром ЭПР называется зависимость мощности поглощения электромагнитной волны от величины магнитной индукции внешнего поля. Чем сильнее взаимодействие между атомами и молекулами образца, тем спектры ЭПР шире. Чем слабее взаимодействие между частицами (подвижность молекул больше), тем уже спектр ЭПР. По ширине спектров ЭПР можно судить о подвижности молекул веществ.

Так как молекулы фосфолипидов диамагнитные, для ЭПР-исследований биомембран используются спин-зонды и спин-метки – молекулы или молекулярные группы с неспаренными электронами.

Парамагнитные спин-зонды вводятся в липидную мембрану, спектры поглощения спин-зондами электромагнитной волны дают информацию о свойствах липидного окружения, в частности о подвижности липидных молекул в мембране. Этот метод обладает существенным недостатком – внесение в биологический объект чужеродных молекул-зондов может изменять структуру объекта. От этого недостатка свободен метод ЯМР.

Ядерный магнитный резонанс – это явление резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волны системой атомных ядер, обладающих магнитным моментом, помещенных во внешнее магнитное поле при резонансной частоте волны.

Как и в случае ЭПР, спектры ЯМР тем шире, чем больше вязкость и меньше молекулярная подвижность исследуемого объекта.