Завдання для самостійної підготовки

1. У хворого закупорка загальної жовчної протоки. Які порушення в перетравлюванні ліпідів це може спричинити?

2. У раціоні спостерігається недостача рибофлавіну, нікотинової кислоти, біотину, піридоксину, ціанокобаламіну, вітаміну В₁₀. Як це вплине на обмін жирів?

3. Аналіз добової сечі показав, що концентрація кетонових тіл становить 100 мг. Оцінити даний показник, вказати можливі причини та наслідки метаболічних порушень.

4. Людина зазнала сильного стресу. Як це вплине на її ліпідний обмін?

5. У хворого виявлено активація процесів перекисного окиснення ліпідів. Чи змінюються при цьому процеси окисного фосфорилювання?

6. Чому тригліцериди є більш ефективним запасом енергії, ніж глікоген?

Лабораторна робота №12

Тема: Метаболізм білків. Кількісне визначення білка за методом Лоурі.

Мета: Ознайомитись із процесами метаболізму білків; методами кількісного визначен­ня білків.

Реактиви: розчини: натрій карбонату (w=2%) в гідроксиді натрію NaOH (С=0,1 моль/дм³), купрум сульфату (w=0,5%) в натрій тартраті (w=3,33%), реактив Фоліна, дистильована вода.

Обладнання: фотоелектроколориметр, кювети, пробірки, штативи.

Питання для підготовки

1. Перетворення білків в процесі травлення.

2. Шляхи перетворення амінокислот у тканинах.

3. Трансамінування: амінотрансферазні реакції, продукти перетворень, регуляція.

4. Дезамінування амінокислот.

5. Декарбоксилування.

6. Обмін аміаку. Біосинтез сечовини.

7. Біосинтез білка.

Теоретичні відомості

За методом Лоурі вимірюють інтенсивність забарвлення розчину, який з'являється в резуль­таті протікання принаймні двох реакцій на білок: біуретової реакції і реакції Фоліна з залишками тирозину і цистеїну у складі білкових молекул. Реактив Фоліна являє собою суміш фосфорно-вольфрамової і фосфорно-молібденової кислот. За учас­ті білка відбувається відновлення цих кислот. Відновлені фор­ми мають інтенсивне синє забарвлення. Вважають, що в реакції відновлення беруть участь комплексні сполуки Купруму, які виникають при взаємодії білка в лужному середовищі з купрум гідроксидом. Метод Лоурі надзвичайно чутливий і дозволяє ви­значати білок у сильно розбавленому розчині, де його вміст ста­новить лише десятки мікрограмів, і, як правило, застосовується для визначення білків в елюатах із колонок при фракціонуван­ні на йонообмінних смолах і сефадексах. За методом Лоурі у розчині визначається не сам білок, а результат його відновної дії на фосфорно-вольфрамову і фосфорно-молібденову кислоти.

Хід роботи

1. Готують розчин для проведення біуретової реакції. Для цього спочатку змішують 49 мл розчину А з 1 мл розчину В. Розчин А являє собою розчин натрій карбонату в розчині натрій гідроксиду. Розчин В являє собою розчин купрум сульфату в розчині натрій чи калій тартрату. До 1 см³ досліджуваного білкового розчину, що містить від 10 до 100 мкг білка, додають 4 см³ суміші розчинів А і В. Перемішують і залишають на 10 хвилин при кімнатній тем­пературі. Потім швидко доливають з піпетки 0,4 см³ реактиву Фоліна, енергійно перемішують і залишають на 30-90 хвилин до появи забарвлення. При цьому жовте забарвлення реактиву Фоліна поступово переходить у синє. Оптичну густину розчину ви­значають на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 750 нм у кюветі з l = 10 мм.

2. Вміст білка в досліджуваній пробі визначають за калібруваль­ним графіком, який будують за розчином будь-якого чистого білка точно відомої концентрації. Краще використовувати роз­чин того білка або суміші білків, які визначають за методом Лоурі. Для цього готують серію розчинів чистого білка, в 1 см³ якого міститься від 20 до 400 мкг білка. Стандартний білок для калібрувального графіка розчиняють у розчині натрій гідрокси­ду (С=0,1 моль/дм³). Серію розчинів готують шляхом розве­дення вихідного концентрованого розчину білка (400 мкг в 1 см³) до необхідних значень. З кожним із зазначених розчинів прово­дять не менше трьох разів реакцію Лоурі, застосовуючи об'єми реагентів, вказані вище (5,4 см³). За отриманими даними буду­ють графік – калібрувальну криву. На ординаті відкладають зна­чення оптичної густини, на абсцисі – вміст білка в пробі.

3. Визначивши оптичну густину досліджуваного розчину білка після проведення реакції Лоурі, на калібрувальному графіку про­водять від певного значення оптичної густини пряму, паралель­ну осі абсцис до перетину з калібрувальною кривою, і опускають перпендикуляр на вісь абсцис. Таким чином визначають вміст білка в пробі досліджуваного розчину. Роблять перерахунки вмісту білка на 100 см³ досліджуваного розчину.

Перевагами визначення білка за методом Лоурі є короткий час визначення порівняно з іншими методами і надзвичайно велика чутливість, що надає можливість визначати слідові кількості білка. Недоліками є те, що за цим методом можна визна­чити лише водорозчинні білки, сине забарвлення розчину не до­сить стійке, що зменшує точність вимірювання.

4. Записати результати досліджень.

5. Записати висновок щодо виконання лабораторного заняття.